《AFM》中南民族大學秦四勇/黃蓉：分層結構的可注射肽液晶水凝膠！

第一作者：黃蓉、蔡創

通訊作者：秦四勇

通訊單位：中南民族大學

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天然骨骼肌的顯著特征在于其高度分層的微結構與有序排列的肌纖維。針對體積性肌肉損失（VML）的治療，研發能夠復制天然肌肉環境分層排列微觀結構的組織支架，既充滿希望又面臨挑戰。此外，理想的支架應具備可調節的成分，以實現特定的功能調控。

近期，中南民族大學秦四勇教授團隊創新性地制備了一種可注射的自組裝肽液晶（LC）水凝膠，其具有分層纖維排列結構，可有效支持骨骼肌再生。為模擬骨骼肌的物理化學功能，將二維碳化鈦納米片Ti3C2Tx MXene作為外源成分引入LC水凝膠，顯著增強了水凝膠的機械強度、抗炎活性和電導率。所得的Ti3C2Tx/LC水凝膠能夠有效引導成肌細胞有序排列，促進成肌分化與血管生成。與無序排列的非液晶（NLC）水凝膠相比，具有分層結構的排列Ti3C2Tx/LC水凝膠在大鼠VML模型中，能夠顯著促進新肌肉組織的形成，并推動肌肉功能恢復。本研究為制備有序排列的水凝膠支架提供了一種高效且實用的策略，在肌肉組織工程和再生醫學領域展現出巨大的應用潛力。文章第一作者是中南民族大學黃蓉副教授和碩士研究生蔡創。該研究得到國家自然科學基金（52273313，22377152）、武漢知識創新計劃-基礎研究（2023020201010150）、中南民族大學中央大學基本科研基金（CZQ24008）、湖北省能源高分子材料工程技術研究中心平臺項目（PTZ24012）的資助。

圖 1、引導肌細胞排列、促進肌肉再生和功能恢復的定向肽液晶水凝膠支架構建示意圖

【研究背景】

體積性肌肉損失（VML）多由嚴重創傷、車禍、腫瘤切除等病理狀況引發，當損傷超出身體再生能力時，會導致肌肉萎縮，損害運動功能并降低生活質量。臨床常用自體肌肉移植治療，但受供體肌肉稀缺、宿主排斥反應及再生效率低等限制。肌肉組織工程通過生物材料支架提供結構支持，展現出治療潛力，但需模擬天然肌肉組織的分層排列纖維結構以引導細胞定向再生?，F有VML支架制造技術（如3D打印、靜電紡絲等）因工藝復雜、成本高、設備專用性強且無法復制天然肌肉的單向分層微環境，實際應用受限。此外，預制支架在細胞包裹、成分調節及適應不規則缺損形狀方面存在不足，亟需開發兼具可注射性、分層排列結構及成分可調性的新型支架。肽類材料憑借生物相容性、結構可設計性、自組裝特性及刺激響應性，成為構建理想支架的候選。其可注射水凝膠特性能填充不規則缺損，通過分子設計可形成分層排列的肽液晶納米纖維結構。本研究旨在設計自組裝肽，構建具有層次比對的水凝膠支架，以實現VML修復與肌肉功能恢復。

【圖文導讀】

1.Ti3C2Tx/LC 水凝膠的建立與表征

仿生 LC水凝膠支架，通過分子自組裝模擬天然骨骼肌的微環境特征?；贑15H31-CONH-VE-CONH2短肽的熱響應自組裝，構建了具有pH依賴性雙折射特性的LC水凝膠：在pH 7.4時形成定向排列的纖維結構（LC水凝膠），而在pH 6.8時呈現隨機取向（NLC水凝膠）。掃描電鏡（SEM）和掃描透射電鏡（STEM）證實，LC水凝膠的纖維呈分級排列，形成包含多級纖維束的微觀結構；流變學分析顯示其具備類固體行為（儲能模量G′＞損耗模量G″）。這種結構差異被歸因于谷氨酸殘基的質子化狀態變化，pH 7.4時去質子化增強靜電排斥，促進納米纖維的有序排列。

為賦予支架多功能性，研究引入Ti3C2Tx-MXene納米材料，構建了Ti3C2Tx/LC雜化水凝膠。摻入后，水凝膠保持各向異性特征（偏光顯微鏡和激光散射驗證），同時機械剛度顯著提升（G′值增加），電導率隨MXene濃度梯度增強?？勺⑸湫詫嶒灡砻鳎琇C水凝膠具備溫度敏感和剪切稀化特性，注射后仍穩定保留雙折射結構。功能上，Ti3C2Tx/LC水凝膠通過清除DPPH自由基（效率提升10倍）和降低細胞內活性氧（ROS），有效緩解氧化應激；同時顯著下調炎癥因子（TNF-α、IL-4等）的mRNA表達，可為成肌細胞增殖和肌源性分化提供支持性微環境，促進VML缺損的功能再生。

圖2.LC、NLC、Ti3C2Tx/NLC和Ti3C2Tx/LC水凝膠的表征。(A)水凝膠的構建示意圖。（B， C） LC和NLC水凝膠與Ti3C2Tx MXene混合前后的照片和POM圖像。（D， E）自組裝肽納米纖維SEM圖像和取向分布統計分析。(F)添加Ti3C2Tx MXene前后LC和NLC水凝膠的儲存模量G’和損耗模量G”。（G-I）不同水凝膠的激光散射圖像、電導率和自由基清除能力分析。

2.Ti3C2Tx /LC 水凝膠對細胞增殖的促進作用及其調控機制

本研究系統驗證了Ti3C2Tx/LC水凝膠的生物相容性及促細胞增殖能力。溶血實驗和活/死細胞染色證實兩種水凝膠均具備高生物相容性。CCK-8測定表明Ti3C2Tx/LC水凝膠中C2C12細胞7天后存活率顯著高于Ti3C2Tx/NLC組，EdU摻入實驗進一步證實LC水凝膠具備更強的促細胞增殖能力。轉錄組分析揭示差異表達基因（DEGs）主要富集于細胞周期、PI3K-Akt及MAPK信號通路，其中Ptx3基因上調與增殖正相關，Angpt1基因下調促進成肌細胞增殖。蛋白質印跡證實LC水凝膠通過上調PCNA及磷酸化Akt、p38 MAPK、JNK、ERK1/2等關鍵信號分子表達，增強PI3K/Akt和MAPK通路活性。研究證明各向異性Ti3C2Tx/LC水凝膠可通過調控關鍵信號通路協調細胞生長，展現作為仿生支架的優異潛力。

圖3.Ti3C2Tx/LC水凝膠促進成肌細胞C2C12增殖的機制。(A)溶血率分析。(B) Ti3C2Tx/NLC和Ti3C2Tx/LC水凝膠對細胞活力的影響。(C) C2C12細胞在Ti3C2Tx/NLC和Ti3C2Tx/LC水凝膠支架中預培養72 h后的EdU染色。(D)基于轉錄組測序的KEGG通路富集分析。(E)細胞增殖相關差異表達基因熱圖。(F) mRNA表達水平定量分析。(G) PCNA、Paxillin、p-AKT、p-Erk1/2、p-p38 MAPK、p-JNK蛋白的Western blot圖。(H)免疫印跡數據定量分析。

3.Ti3C2Tx /LC 水凝膠對細胞定向排列和遷移的促進作用

Ti3C2Tx/LC水凝膠通過模擬天然骨骼肌的分層排列結構，有效引導細胞定向生長與遷移。實驗表明，在LC水凝膠表面培養的C2C12成肌細胞、HUVEC內皮細胞和3T3成纖維細胞均呈現細長形態及顯著定向排列（取向角集中于20°范圍內），而NLC水凝膠和2D對照組細胞呈隨機分布；純LC水凝膠（無Ti3C2Tx）同樣證實結構本身是接觸引導的關鍵因素。定量分析顯示LC水凝膠組細胞擴散面積更大、縱橫比更高，且12小時內完成動態排列過程。遷移實驗進一步揭示，預培養于LC水凝膠的細胞，其2D劃痕于36小時完全閉合，且3D transwell遷移細胞數量較對照組提升明顯。研究證明該肽液晶水凝膠的分級纖維排列作為地形線索，可主動調控細胞行為，為肌肉組織再生提供仿生微環境支持。

圖4.Ti3C2Tx/LC水凝膠對細胞排列和遷移的調控作用。(A) C2C12、HUVEC和3T3細胞在二維表面、Ti3C2Tx/NLC水凝膠、Ti3C2Tx/LC水凝膠中培養后的共聚焦圖像，并對細胞方向分布進行統計分析。C2C12細胞取向在(B) -20°—20°范圍內，(C)細胞鋪展面積，(D)細胞長寬比的比例。(E) C2C12細胞劃痕實驗結果圖像和(F)定量分析。(G) C2C12細胞Transwell實驗結果圖像和(H)定量分析。

4.Ti3C2Tx /LC 水凝膠支架誘導成肌分化、ECM構建和血管生成

Ti3C2Tx/LC水凝膠對肌肉再生關鍵過程起調控作用。Western印跡分析顯示，與2D培養組及NLC水凝膠組相比，LC水凝膠組中C2C12細胞的肌球蛋白重鏈（MHC）蛋白，3T3細胞的I型膠原（ECM關鍵成分）和波形蛋白（細胞骨架標志物），HUVEC的血管標志物CD31（促進血管腔形成）和eNOS（調節血管舒張）均顯著上調。RT-qPCR進一步證實，LC水凝膠組MHC和增殖標志物PCNA的mRNA含量最高，而肌肉生長抑制素（負調控肌生長）水平最低。功能上，鬼筆環肽染色顯示LC水凝膠促進更密集的F-actin細胞骨架網絡形成，增強細胞附著與遷移能力；HUVEC血管生成實驗中，LC水凝膠組管數、連接點、網格面積及血管長度等指標顯著優于NLC組。肌管形成實驗表明，LC水凝膠支架引導C2C12細胞融合為對齊的多核長條肌管，融合指數達17%，顯著高于2D及NLC組的隨機取向肌管。綜上，Ti3C2Tx/LC水凝膠通過協同調控肌源性分化、ECM重塑、血管生成及細胞骨架組織，為肌肉組織協調再生提供了獨特的仿生微環境。

圖5. Ti3C2Tx/LC水凝膠對細胞外基質構建、血管生成和成肌分化的誘導作用。(A-B) C2C12細胞內MHC、3T3細胞內I型膠原和vimentin、HUVEC細胞內CD31和eNOS蛋白的 Western blotting圖像和相對蛋白表達水平分析。(C) C2C12細胞中myostatin、PCNA、MHC mRNA的 RT-qPCR定量分析。(D) C2C12細胞在水凝膠上預培養三天的細胞骨架形態染色圖。(E) HUVEC細胞在水凝膠上預培養一天的血管生成圖像和(F)定量分析（管、節點、網數、總網面積）。(G)培養七天后水凝膠支架內形成肌管的二維和三維免疫熒光圖像及取向分布。 (H)肌管數，(I)長度，(J)肌管融合指數的定量分析。

5.Ti3C2Tx /LC 水凝膠對肌肉組織和功能的修復作用

構建大鼠脛骨前肌（TA）VML模型。14天組織學分析和免疫熒光顯示，與未處理VML模型組及Ti3C2Tx/NLC組相比，Ti3C2Tx/LC水凝膠組顯著促進肌肉再生（新纖維直徑/數量增加）和血管生成（CD31標記密集），同時膠原蛋白沉積最少，肌球蛋白表達更接近健康組織水平，組織再生更有序。此外，內臟器官及體重監測證實了該支架的生物相容性。

隨后通過礦場試驗和肌電圖實驗，評估了各向異性Ti3C2Tx/LC水凝膠支架對大鼠脛骨前肌的功能恢復效果。與未處理的VML模型組及Ti3C2Tx/NLC水凝膠組相比，Ti3C2Tx/LC水凝膠組大鼠的行進距離顯著增加，活動范圍擴展至整個實驗區，并頻繁探索中心區域。第28天，Ti3C2Tx/LC水凝膠組經電刺激后的骨骼肌張力明顯高于其他兩組。以上結果表明，具有對齊和分級微觀結構的Ti3C2Tx/LC水凝膠支架通過模擬天然骨骼肌的拓撲特征，有效促進了骨骼肌的組織再生及運動功能恢復。

圖6. Ti3C2Tx/LC水凝膠支架植入大鼠體積性肌肉損失模型后對骨骼肌組織的修復。(A)大鼠體積性肌肉損失圖像。(B) Ti3C2Tx/LC水凝膠介導的體積性肌肉損失修復示意圖。(C)第14天 H&E染色圖。(D) VML周圍肌纖維直徑。(E)有核肌纖維數目（新肌纖維）。(F)第14天再生肌肉的Masson染色圖。(G)再生肌肉中膠原蛋白覆蓋率分析。(H)組織切片中肌球蛋白重鏈（MHC，紅色）、CD31（綠色）和細胞核（DAPI）的免疫熒光染色。(1)缺陷區域附近的毛細管面積。

圖7. Ti3C2Tx/LC水凝膠支架植入大鼠體積性肌肉損失模型后對骨骼肌功能的恢復。(A)礦場實驗示意圖。(B) 第14天實驗大鼠的代表性運動軌跡和(C)總運動距離。(D)肌電圖實驗示意圖。(E) 第28天各組代表性肌電圖。(F) 第28天再生肌肉組織的收縮能力。

【總結與展望】

這項研究開發了一種結合地形和生化線索的可注射肽LC水凝膠支架，有效地填補肌肉缺陷，引導細胞排列，并促進肌肉再生。通過分子自組裝和熱誘導排列，不需要持續的外部刺激或引導系統，構建了一個復制天然骨骼肌細胞骨架的分層結構、定向排列的肽水凝膠支架。通過加入Ti3C2Tx MXene，其生物活性進一步增強，可產生ROS清除及抗炎活性，并改善電導率。Ti3C2Tx/LC水凝膠在促進細胞定向排列、增殖和遷移、成肌分化和血管生成方面的顯著能力。在大鼠體積性肌肉損失模型中，Ti3C2Tx/LC水凝膠在促進肌纖維形成、血管生成和功能恢復方面優于未對齊的水凝膠，強調了其重現天然肌肉組織微環境的能力?？傊?，該仿生肽LC水凝膠支架有望成為促進肌肉組織修復和神經元再生的多功能治療平臺。

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202500204

【通訊作者簡介】

秦四勇，博士，教授，碩士生導師，主要從事生物醫用材料的基礎與應用研究。2014年獲武漢大學高分子化學與物理博士學位（導師：卓仁禧院士、張先正教授），同年7月進入貴州大學材料與冶金學院工作，次年4月加入中南民族大學化學與材料科學學院。主持國家自然科學基金2項、湖北省面上基金2項及教育部學術創新項目等近10項，參與國家/省部級重點項目多項。以第一/通訊作者在Coord. Chem. Rev., Angew. Chem. Int. Ed., ACS Nano等國際期刊發表論文40余篇，含ESI高被引論文2篇、熱點論文1篇，授權中國發明專利6項。曾獲教育部武漢大學博士學術新人獎、湖北省優秀博士學位論文、研究生國家獎學金、武漢大學學術創新獎一等獎等榮譽。

黃蓉，博士，副教授，碩士生導師。2014年獲得武漢大學有機化學博士學位, 2015年4月加入中南民族大學藥學院，致力于新型生物活性分子的創新發現與功能研究，以應對腫瘤、耐藥性細菌感染及難治性自身免疫性疾病的臨床治療挑戰。主持2項國家自然科學基金，并參與10余項國家級和省部級科研項目。以第一作者或通訊作者身份在Adv. Funct. Mater., J. Control Release, Acta Biomater., Int. J. Biol. Macromol.等國際期刊發表論文30余篇，并授權6項國家發明專利。