神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵目標(biāo)是繪制完整的哺乳動物神經(jīng)回路，但傳統(tǒng)技術(shù)存在三大核心限制：熒光蛋白在組織透明化過程中易淬滅，無法有效標(biāo)記精細(xì)神經(jīng)結(jié)構(gòu)（如長距離軸突投射）。基于 IgG 抗體或納米抗體的標(biāo)記方法，因分子量大（IgG 約 150kDa）導(dǎo)致組織穿透性差，信號隨組織深度顯著衰減。現(xiàn)有 AAV 稀疏標(biāo)記技術(shù)的標(biāo)記密度隨時間逐漸增加，導(dǎo)致樣本間差異大，難以實現(xiàn)單個神經(jīng)元的精準(zhǔn)形態(tài)重建。高亮的小鼠全腦/全身神經(jīng)元快速化學(xué)熒光標(biāo)記方法LINCS可解決以上問題。

LINCS實驗流程

向 Cre 工具鼠（如 Sert-Cre、DAT-Cre）的目標(biāo)腦區(qū)注射 Cre 依賴型 AAV（攜帶 seTurboID 基因），表達(dá)周期僅需3 周（傳統(tǒng)熒光蛋白需 > 1 個月）。

體內(nèi)生物素化：小鼠飲用含 2mM 生物素的水 1 周，使 seTurboID 催化生物素結(jié)合到目標(biāo)神經(jīng)元蛋白上。

整體染色：使用熒光偶聯(lián)的單價鏈霉親和素進(jìn)行染色，3 天即可完成（42℃加熱可加速），無需傳統(tǒng)抗體的多周孵育。

組織透明化與成像：采用 DISCO透明化技術(shù)結(jié)合光片顯微鏡成像，全腦成像時間約8 小時。

CRISPR-Cas9介導(dǎo)的穩(wěn)定稀疏標(biāo)記系統(tǒng)

為實現(xiàn)單個神經(jīng)元的精準(zhǔn)重建，開發(fā)了基于 AAV 的 Cre 敲除系統(tǒng)解決傳統(tǒng)稀疏標(biāo)記不穩(wěn)定的問題：

技術(shù)原理：通過AAV表達(dá)SaCas9和靶向Cre基因的多條sgRNA，在Cre工具鼠中特異性敲除部分神經(jīng)元的Cre，使僅保留Cre活性的神經(jīng)元可被后續(xù)Cre依賴載體標(biāo)記，實現(xiàn)穩(wěn)定稀疏標(biāo)記。

調(diào)控方式：通過以下 3 種方式精準(zhǔn)控制稀疏度：

調(diào)整 Cre-KO AAV 的滴度；

改變 Cre-KO 的作用時間；

調(diào)整 sgRNA 的數(shù)量。

傳統(tǒng)雙AAV稀疏標(biāo)記因病毒持續(xù)表達(dá)，2個月后標(biāo)記細(xì)胞增加超30%，穩(wěn)定性差。而CRISPR-Cas9 Cre敲除系統(tǒng)通過永久失活部分神經(jīng)元的Cre基因，實現(xiàn)不可逆的稀疏標(biāo)記，使標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量長期穩(wěn)定，顯著提升了標(biāo)記的持久性與可靠性。

LINCS應(yīng)用場景

腦內(nèi)神經(jīng)連接圖譜繪制

血清素能神經(jīng)元：在 Sert-Cre 小鼠中標(biāo)記 DRN（中縫背核）血清素能神經(jīng)元，LINCS 可清晰顯示全腦范圍內(nèi)的投射。

多巴胺能神經(jīng)元：在 DAT-Cre 小鼠中標(biāo)記 VTA（腹側(cè)被蓋區(qū)）和 SNc（黑質(zhì)致密部）多巴胺能神經(jīng)元，LINCS 標(biāo)記的軸突信號強(qiáng)度在半腦樣本中是 iDISCO + 的 1.8 倍且能精準(zhǔn)重建紋狀體（STR）的局部分支模式。

GABA 能神經(jīng)元：在 Vgat-Cre 小鼠中標(biāo)記 VTA GABA 能神經(jīng)元，成功區(qū)分中間神經(jīng)元和投射神經(jīng)元。

長距離神經(jīng)投射標(biāo)記

皮質(zhì)脊髓束：向 CaMKII-Cre 小鼠頸髓（C7-C8 節(jié)段）注射逆行 AAV（AAV2-retro），攜帶 mem-seTurboID（膜定位 seTurboID），3 周后可清晰顯示從大腦運動皮層（M1/M2）、軀體感覺皮層（S1/S2）到脊髓 L3 節(jié)段的軸突束及單個軸突，分辨率達(dá)單個軸突水平。

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外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）標(biāo)記

全鼠體 PNS 標(biāo)記：通過靜脈注射 AAV-MaCPNS2（外周神經(jīng)靶向 AAV 血清型），攜帶 hSyn-mem-seTurboID，3 天后可標(biāo)記全鼠體的外周神經(jīng)元，包括皮膚內(nèi)的感覺神經(jīng)末梢；胃腸道（小腸、大腸）的腸神經(jīng)系統(tǒng)；尾巴和爪子的神經(jīng)纖維，實現(xiàn)中樞與外周神經(jīng)回路的聯(lián)合繪制。

與擴(kuò)展顯微鏡（ExM）的兼容性

LINCS 可與蛋白保留擴(kuò)展顯微鏡（proExM）結(jié)合：直接使用熒光偶聯(lián)鏈霉親和素標(biāo)記，可分辨神經(jīng)元精細(xì)結(jié)構(gòu)；結(jié)合 isHCR（免疫信號雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），信號強(qiáng)度可進(jìn)一步提升 2 倍，滿足超高分辨率成像需求（擴(kuò)展后樣本體積擴(kuò)大 100-1000 倍，信號仍清晰）。

該技術(shù)整合了多項創(chuàng)新，構(gòu)建了一套高效解析哺乳動物全腦神經(jīng)環(huán)路的完整流程。通過工程化的溶解度增強(qiáng)型生物素連接酶（如seTurboID）在活體內(nèi)實現(xiàn)廣泛生物素化，結(jié)合單價鏈霉親和素進(jìn)行快速、低背景的整體染色，有效解決了傳統(tǒng)方法中標(biāo)記效率低和信號隨組織深度衰減的問題。該標(biāo)記策略與組織透明化技術(shù)和光片顯微鏡相結(jié)合，可實現(xiàn)對完整大腦乃至全鼠體標(biāo)本的高分辨率、大尺度三維成像。同時，開發(fā)的基于CRISPR-Cas9的Cre敲除AAV系統(tǒng)，可在基因型小鼠中實現(xiàn)穩(wěn)定且稀疏的神經(jīng)元標(biāo)記，滿足單神經(jīng)元水平精細(xì)回路解析的需求。

文獻(xiàn)引用

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.08.022

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