提到乳酸, 很多人會想到運動后肌肉酸痛的“罪魁禍首”, 但現代生物學早已證實, 乳酸絕非簡單的“代謝廢物”——它是細胞的能量燃料、合成原料, 更是調控生理病理過程的關鍵信號分子 [1] ( 圖1 ), 參與癌癥、糖尿病、神經退行性疾病等多種疾病的發生發展等 [ 1 ~ 3 ] . 乳酸代謝呈現顯著的動態變化和復雜的空間分布, 然而由于缺乏能實時、精準追蹤乳酸在細胞內分布與動態變化的工具, 乳酸代謝的重要科學問題仍難以解決.

圖 1 乳酸代謝的重要性(使用BioRender.com制圖)

長期以來, 檢測乳酸主要依靠酶循環分析、色譜法、質譜法等傳統技術, 這些方法檢測代謝物種類覆蓋面廣, 但需要破壞細胞或組織, 無法實現活細胞、亞細胞及活體的實時檢測與分布定量. 為了解決該問題, 研究人員通過兩種策略已經開發了一系列乳酸熒光蛋白探針 [4] : 一是在具備可發生熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的兩個熒光蛋白之間嵌入乳酸結合域(FRET型乳酸熒光蛋白探針); 二是將乳酸結合域插入到熒光蛋白內部, 或是將環狀熒光蛋白(circularly permuted fluorescent protein, cpFP)插入到乳酸結合域(單熒光蛋白型熒光蛋白探針). 然而, 先前已開發的乳酸熒光蛋白探針存在動態范圍小、特異性差、親和力不適合生理條件、需要外源添加鈣離子等應用限制. 考慮到哺乳動物細胞內的乳酸水平約 0.6~1?mmol L–1, 血液中約 0.8~2?mmol L–1 [5] , 我們團隊原創了一系列高性能的單熒光蛋白型乳酸熒光蛋白探針FiLa( f luorescent i ndicator of la ctate), 具有高響應性、適宜的親和力( K d)以及極高的特異性 [ 6 , 7 ] . 其中, FiLa( K d約 130?μmol L–1, 響應倍數約1500%)、FiLa-H( K d約 20?μmol L–1, 響應倍數約2600%)、FiLa-L( K d約 800?μmol L–1, 響應倍數約700%), 對乳酸具有極高的選擇性, 不受核苷酸, 糖酵解和三羧酸循環中的代謝物、其他氨基酸及Ca2+、Mg2+的干擾, 在20~40℃溫度范圍內性能穩定, pH耐受性強, 響應迅速可逆, 可根據具體實驗需求用于細胞漿、線粒體、細胞核、活體與臨床體液的檢測.

我們通過文獻調研發現大腸桿菌來源的乳酸結合蛋白(L-lactate dehydrogenase operon regulatory protein, LldR)與乳酸結合后會發生顯著的構象變化 [8] . 于是, 我們將環狀黃色熒光蛋白(circularly permuted yellow fluorescent protein, cpYFP)巧妙地插入到LldR的無規卷曲區域, 當LldR與乳酸結合并發生構象變化時, 會帶動cpYFP的結構改變, 進而引發其熒光發生變化. 進一步通過截短LldR的非必需區域提升探針響應幅度, 通過關鍵位點隨機突變調整探針 K d, 獲得適合生理條件檢測或微量體液檢測的探針FiLa、FiLa-H和FiLa-L(探針熒光比值R485/420的上升或下降表征了乳酸水平的增加或減少)和pH對照探針FiLa-C(可校正系列FiLa探針在檢測過程中pH波動帶來的干擾, 讓乳酸檢測結果更加精準)( 圖2 ).

圖 2 乳酸熒光蛋白探針的開發與應用(使用BioRender.com制圖)

通過結合信號定位肽, 我們將FiLa表達在細胞漿、細胞核、線粒體等亞細胞器, 首次揭示了線粒體中的乳酸水平 (268~1025?μmol L–1) 顯著高于細胞漿/細胞核(53~ 89?μmol L–1), 顛覆了“乳酸主要存在于細胞漿”的傳統認知. 同時, 我們構建了高通量藥物篩選體系, 覆蓋2種癌細胞系、4大亞細胞區間(細胞外、細胞漿、細胞核、線粒體), 并在葡萄糖充足或缺乏條件下, 評估24種靶向10條核心代謝通路的小分子化合物對乳酸穩態的影響, 揭示乳酸是整合多條代謝通路信號的“中央傳感器”, 系統解析了乳酸代謝的精細調控網絡. 此外, 胞外乳酸水平與胞內乳酸池常呈背離趨勢, 直接挑戰了“胞外酸化速率=糖酵解活性”的傳統推斷( 圖2 ).

我們建立了基于重組腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)遞送或細胞膠囊移植的活體乳酸動態成像方法. 通過AAV將FiLa探針遞送到糖尿病小鼠的肌肉組織中, 原位監測了1型和2型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM和type 2 diabetes mellitus, T2DM)小鼠的肌肉乳酸代謝差異, 并實時監測了T1DM小鼠在胰島素治療下的乳酸動態變化; 通過FiLa細胞膠囊移植小鼠背部, 實時監測藥理調控作用下的小鼠體內乳酸波動, 展示了FiLa在活體代謝監測中的應用潛力( 圖2 ).

基于FiLa和FiLa-H, 我們建立了臨床微量體液樣本的高通量、便捷式的乳酸即時檢測技術, 僅需 0.5?μL 血清或 2.5?μL 尿液, 就能在 1?min 內完成乳酸定量檢測. 通過測定成人隱匿性自身免疫性糖尿病(T1DM的分型)、T2DM、母系遺傳性糖尿病伴耳聾(maternally inherited diabetes and deafness, MIDD, 經常被誤診為I型或II型糖尿病)患者以及健康人的血清與尿液乳酸, 發現MIDD患者的尿液乳酸顯著高于T1DM、T2DM及健康人, 可能作為該疾病的潛在篩查標志物, 形成了具有自主知識產權的重要原創成果 [9] , 為臨床診斷提供了重要依據( 圖2 ). 本團隊原創的FiLa不僅實現了乳酸代謝監測技術在高時空分辨率上的突破, 更助力了生命科學研究的進一步發展. 利用FiLa亞細胞器定量乳酸的優勢, 獲得了“線粒體基質內存在高濃度乳酸”的突破性發現, 重新定義了線粒體在乳酸代謝中的角色 [6] . 利用FiLa建立了乳酸監測一站式解決方案 [ 7 ] , 推動乳酸代謝在腫瘤代謝重編程、神經細胞能量供應、免疫細胞功能調控等領域的深入研究. 鑒于乳酸的重要研究價值, 近年來, 科研人員不斷開發乳酸熒光蛋白探針, 已發展了7種單熒光蛋白型和2種FRET型的乳酸熒光蛋白探針, 可以根據實驗需求靈活選用 [10] .

近年來, 我們團隊原創了系列高性能代謝熒光蛋白探針, 涵蓋細胞內核心代謝物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD(H)) [11] 、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH) [12] , 過氧化氫 [13] , 精氨酸 [ 14 , 15 ] 等, 可應用于高通量/全景式代謝表型分析 [16] 、藥物高通量篩選、個性化用藥指導及臨床疾病精準診斷等, 形成了在活細胞代謝熒光蛋白探針領域的國際領先優勢, 為服務“面向人民生命健康”的新時代新需求提供關鍵技術支撐.

參考文獻

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