2026年5月，浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、浙江省血瘀毒證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、浙江省中醫(yī)藥“治未病”智慧健康工程研究中心等團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合浙江省腫瘤醫(yī)院病理科、浙江中醫(yī)藥大學(xué)金華研究院等單位，在Phytomedicine在線發(fā)表題為 “Targeting the lactate-lactylation-glucose uptake axis: Cryptotanshinone reprograms metabolic-epigenetic crosstalk in gastric cancer” 的研究論文。該文于2025年12月23日投稿，2026年5月10日修回，2026年5月26日接收，2026年5月28日在線發(fā)表。論文通訊作者為浙江中醫(yī)藥大學(xué) Tao Jiang（姜濤） 和 Guangji Zhang（張光霽）。Phytomedicine 公開期刊信息顯示其最新影響因子約為8.3，并被列為JCR Q1/中科院醫(yī)學(xué)1區(qū)Top期刊。

胃癌仍是全球癌癥相關(guān)死亡的重要原因之一。當(dāng)前一線治療主要依賴系統(tǒng)性化療，但化療耐藥和嚴(yán)重不良反應(yīng)限制了長期療效。近年來，腫瘤代謝重編程受到廣泛關(guān)注，其中乳酸不再只是糖酵解終產(chǎn)物，還可通過組蛋白乳酰化參與表觀遺傳調(diào)控，推動腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸。該研究聚焦胃癌中的 乳酸-乳酰化-葡萄糖攝取軸，試圖從代謝與表觀遺傳串?dāng)_角度尋找新的干預(yù)機(jī)制。

研究團(tuán)隊(duì)首先從丹參乙醇提取物（SME）入手，通過HPLC-MS分析共鑒定出596種化合物，并發(fā)現(xiàn)SME可降低胃癌細(xì)胞乳酸分泌和PEP水平，同時抑制烯醇化酶活性。進(jìn)一步結(jié)合基于ENO1結(jié)構(gòu)的高通量篩選、有限蛋白酶解-質(zhì)譜（LiP-MS）、表面等離子體共振（SPR）、細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（CETSA）和DARTS實(shí)驗(yàn)，研究者鑒定出丹參活性成分 隱丹參酮（cryptotanshinone，CTS） 可直接結(jié)合并抑制 烯醇化酶1（ENO1）。

機(jī)制上，CTS通過靶向ENO1降低磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和乳酸生成，進(jìn)而減少全局組蛋白乳酰化，尤其是 H3K18la。與此同時，CTS降低PEP水平后，可增強(qiáng)HDAC2介導(dǎo)的去乳酰化作用。H3K18la下降進(jìn)一步抑制 MGAT4A 表達(dá)，削弱 GLUT1 的細(xì)胞膜定位和葡萄糖攝取，從而形成“葡萄糖攝取-糖酵解-乳酸生成”負(fù)反饋環(huán)路，系統(tǒng)性抑制胃癌細(xì)胞能量供應(yīng)。

在功能驗(yàn)證方面，CTS在胃癌細(xì)胞中抑制增殖、遷移和三維侵襲，并在較高濃度下誘導(dǎo)凋亡。體內(nèi)異種移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示，CTS可劑量依賴性減緩腫瘤生長，高劑量組抗腫瘤效果接近陽性對照順鉑；同時，小鼠主要器官HE染色及ALT、AST、BUN、CREA等指標(biāo)未見明顯毒理學(xué)變化。更進(jìn)一步，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建患者來源胃癌類器官（PDOs），發(fā)現(xiàn)CTS同樣能夠抑制類器官生長和乳酸分泌，而外源性乳酸可部分逆轉(zhuǎn)CTS的抑制作用，進(jìn)一步支持“乳酸依賴性”機(jī)制。

總體來看，該研究從天然產(chǎn)物活性成分篩選出發(fā)，建立了“CTS-ENO1-PEP/乳酸-H3K18la-MGAT4A/GLUT1”的機(jī)制鏈條，揭示隱丹參酮可通過重塑胃癌代謝-表觀遺傳串?dāng)_抑制腫瘤進(jìn)展。這一發(fā)現(xiàn)不僅拓展了丹參活性成分隱丹參酮的抗腫瘤機(jī)制，也為靶向乳酸代謝和組蛋白乳酰化的胃癌干預(yù)策略提供了前臨床依據(jù)。需要強(qiáng)調(diào)的是，該研究主要基于細(xì)胞、異種移植瘤和患者來源類器官模型，尚不能直接等同于人體臨床療效，后續(xù)仍需進(jìn)一步開展藥代動力學(xué)、安全性和臨床轉(zhuǎn)化研究。

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【摘要】

背景：胃癌仍是全球癌癥相關(guān)死亡的重要原因之一。化療耐藥和嚴(yán)重不良反應(yīng)，是當(dāng)前治療面臨的主要挑戰(zhàn)。代謝重編程，尤其是乳酸驅(qū)動的組蛋白乳酰化，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。隱丹參酮（cryptotanshinone，CTS）是來源于丹參（Salvia miltiorrhiza）的活性成分，已顯示出抗腫瘤特性，但其在胃癌中調(diào)控乳酸代謝和乳酰化的機(jī)制尚不清楚。

目的：本研究旨在闡明 CTS 抑制胃癌進(jìn)展的分子機(jī)制，重點(diǎn)關(guān)注其對烯醇化酶活性、乳酸生成、組蛋白乳酰化以及下游代謝-表觀遺傳調(diào)控的影響。

方法：研究者篩選丹參乙醇提取物（Salvia miltiorrhiza ethanol extract，SME），并鑒定出 CTS 是靶向烯醇化酶的關(guān)鍵成分。研究采用分子對接、表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）和有限蛋白酶解-質(zhì)譜（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）確認(rèn) CTS 與烯醇化酶 1（enolase 1，ENO1）之間的相互作用。隨后，研究者利用細(xì)胞系、異種移植瘤和患者來源類器官（patient-derived organoids，PDOs）等體內(nèi)外模型評估 CTS 的抗腫瘤效應(yīng)，并通過 Seahorse 檢測、Western blot、Cut&Tag 和 RNA-seq 等方法分析糖酵解功能、組蛋白乳酰化和基因表達(dá)變化。

結(jié)果：CTS 可直接結(jié)合并抑制 ENO1，從而降低磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）和乳酸生成。乳酸水平下降進(jìn)一步降低全局組蛋白乳酰化，尤其是組蛋白 H3 第 18 位賴氨酸乳酰化（histone H3 lysine 18 lactylation，H3K18la）。此外，CTS 通過降低 PEP 水平增強(qiáng)組蛋白去乙酰化酶 2（histone deacetylase 2，HDAC2）介導(dǎo)的去乳酰化作用，而 PEP 原本可抑制 HDAC2。H3K18la 下調(diào)抑制 MGAT4A 表達(dá)，削弱葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1（GLUT1）的細(xì)胞膜定位和葡萄糖攝取，從而形成抑制糖酵解的反饋環(huán)路。CTS 在異種移植瘤和患者來源類器官模型中顯著抑制腫瘤生長，而外源性乳酸可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。

01

研究背景及科學(xué)問題

胃癌仍是全球重要的健康挑戰(zhàn)，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。目前，一線治療主要依賴系統(tǒng)性化療。然而，化療療效常受到耐藥和嚴(yán)重不良反應(yīng)限制，長期治療結(jié)局并不理想。當(dāng)前，程序性死亡配體 1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表達(dá)、微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（high microsatellite instability，MSI-H）和腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）等生物標(biāo)志物已被用于指導(dǎo)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）治療，但它們在預(yù)測化療反應(yīng)方面仍存在局限。此外，目前仍缺乏可靠的生物學(xué)指標(biāo)來識別哪些患者更可能從化療中獲益，這直接導(dǎo)致個體間對系統(tǒng)性化療的反應(yīng)差異顯著。在精準(zhǔn)腫瘤學(xué)時代，亟需發(fā)現(xiàn)新的分子靶點(diǎn)，并開發(fā)能夠選擇性抑制腫瘤進(jìn)展、同時降低毒性的治療策略。

越來越多證據(jù)表明，代謝重編程在癌癥發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。在多種代謝物中，乳酸已被認(rèn)為是胃癌中的關(guān)鍵致癌代謝物。乳酸不僅是糖酵解的終產(chǎn)物，還可通過一種新發(fā)現(xiàn)的翻譯后修飾形式——乳酰化（lactylation）參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)和表觀遺傳調(diào)控。組蛋白乳酰化，尤其是 H3K9、H3K14 和 H3K18 等賴氨酸位點(diǎn)的乳酰化，可直接促進(jìn)與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。乳酸驅(qū)動的這種表觀遺傳重編程可形成前饋環(huán)路，維持胃癌侵襲性表型。因此，靶向乳酸代謝或乳酰化，可能成為一種有前景的治療方向。

中醫(yī)藥長期以來將草本化合物用于腫瘤治療。丹參在傳統(tǒng)應(yīng)用中常用于活血化瘀，現(xiàn)代研究也證實(shí)其具有抗腫瘤特性。在丹參活性成分中，隱丹參酮（CTS）是含量較高且具有代表性的二萜醌類化合物之一，已在多種惡性腫瘤中顯示出抗癌作用。既往研究提示，CTS 可抑制糖酵解和氧化磷酸化，并調(diào)控 STAT3/SIRT3 等信號通路。雖然已有研究顯示 CTS 對乳酸調(diào)控具有重要影響，但其在胃癌中是否影響乳酰化介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控，以及其在糖酵解通路中的直接分子靶點(diǎn)，仍缺乏深入研究。本研究鑒定了 CTS 調(diào)控乳酸的直接生物學(xué)靶點(diǎn)，并闡明了其降低組蛋白乳酰化的三重作用，為 CTS 后續(xù)作為分子工具開發(fā)和應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

丹參乙醇提取物可抑制烯醇化酶活性

丹參的抗腫瘤價值已有較多研究基礎(chǔ)，尤其與其丹參酮類和酚酸類成分相關(guān)。研究者首先采用兩親性溶劑對丹參進(jìn)行純化，制備丹參乙醇提取物（SME），并通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）進(jìn)行成分分析，共鑒定出 596 種化合物。隨后，研究者采用 CCK-8 實(shí)驗(yàn)評估 SME 的抗胃癌活性，結(jié)果顯示 SME 約從 1 μg/mL 開始表現(xiàn)出抑制作用。

研究者注意到，SME 處理后的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基顏色發(fā)生明顯變化，因此進(jìn)一步對 HGC-27 細(xì)胞經(jīng) SME 處理 24 h 后的培養(yǎng)基進(jìn)行代謝組學(xué)分析。KEGG 富集分析顯示，隨著 SME 濃度升高，細(xì)胞代謝通路的富集程度最高。乳酸是重要的腫瘤代謝物，可迅速酸化細(xì)胞外環(huán)境。實(shí)驗(yàn)觀察到，SME 可顯著降低胃癌細(xì)胞的細(xì)胞外乳酸分泌。

為初步解析這一抑制機(jī)制，研究者依次補(bǔ)充糖酵解末端代謝中間產(chǎn)物。結(jié)果顯示，加入丙酮酸和 PEP 可顯著恢復(fù) SME 誘導(dǎo)的乳酸下降，而 2-磷酸甘油酸（2-phosphoglycerate，2-PG）不能恢復(fù)。這提示，烯醇化酶催化 2-PG 轉(zhuǎn)化為 PEP 的步驟，可能是 SME 發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析顯示，在 TCGA 數(shù)據(jù)庫中，ENO1 在所有胃腸道腫瘤中均高表達(dá)，ENO2 和 ENO3 中度上調(diào)。CCLE 數(shù)據(jù)庫中 17 種常用胃癌細(xì)胞系的表達(dá)譜也顯示，ENO1 幾乎在所有胃癌細(xì)胞系中高表達(dá)，ENO2 和 ENO3 中度表達(dá)，而 ENO4 幾乎缺失。

不過，特定濃度的 SME 處理并未改變 HGC-27 和 AGS 細(xì)胞中 ENO 蛋白水平。Amplex Red 定量檢測顯示，SME 可顯著降低胃癌細(xì)胞中的 PEP 水平。隨后檢測烯醇化酶活性發(fā)現(xiàn)，SME 處理 24 h 后，AGS 和 HGC-27 胃癌細(xì)胞中的烯醇化酶活性均顯著下降。因此，SME 是一種能夠調(diào)控烯醇化酶活性的有效成分來源。

圖1：SME 被鑒定為烯醇化酶抑制劑。（A）SME 處理 24 h 后，通過 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞活力。（B）SME 處理 24 h 后，對 HGC-27 細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行代謝組學(xué)分析。（C）SME 處理 24 h 后，檢測胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中的 L-乳酸含量。（D）SME 與其他代謝物共同處理胃癌細(xì)胞 24 h 后，檢測乳酸含量。（E）局部乳酸代謝示意圖。（F）TCGA 數(shù)據(jù)庫中 ENO 家族的表達(dá)水平。（G）CCLE 數(shù)據(jù)庫中胃癌細(xì)胞系的 ENO 表達(dá)情況。（H）SME 處理 24 h 后，胃癌細(xì)胞中 ENO 蛋白表達(dá)水平。（I）SME 處理 24 h 后，通過 Amplex Red 實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞中的 PEP 含量。（J）SME 處理 24 h 后檢測 ENO 酶活性。原圖中出現(xiàn) ns、、、 等統(tǒng)計學(xué)標(biāo)記；按全文統(tǒng)計學(xué)方法，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns 表示無統(tǒng)計學(xué)意義。

CTS 被鑒定為靶向 ENO1 的烯醇化酶抑制劑

為尋找具有 ENO 抑制活性的潛在化合物，研究者從 PubChem 獲取了 458 種具有明確三維結(jié)構(gòu)的化合物。利用基于蛋白結(jié)構(gòu)的反向篩選技術(shù)，研究者以 ENO1 二聚體的催化口袋作為對接中心，計算每種化合物與該口袋的親和力。結(jié)果顯示，Neoprzewaquinone A 和 Isoginkgetin 具有最高親和力。最終，研究者根據(jù)最高對接得分、最高含量得分，或?qū)拥梅峙c含量得分綜合排序較高等標(biāo)準(zhǔn)，選擇 6 種化合物進(jìn)行驗(yàn)證。

在 HGC-27 細(xì)胞低毒性濃度條件下，隱丹參酮（CTS）和丹參酮 I 對乳酸分泌的抑制最為明顯。既往研究提示 CTS 可降低腫瘤細(xì)胞糖酵解，但未明確涉及烯醇化酶。因此，研究者進(jìn)一步聚焦 CTS 介導(dǎo)糖酵解抑制的具體機(jī)制。

通過有限蛋白酶解蛋白質(zhì)組學(xué)，研究者鑒定了可能與 CTS 直接結(jié)合的蛋白靶點(diǎn)。其中，3 條 ENO1 肽段和 1 條 ENO2 肽段顯著上調(diào)，引起研究者關(guān)注。隨后，純化 ENO1 蛋白與 CTS 的 SPR 分析顯示二者可有效結(jié)合，穩(wěn)態(tài)親和力擬合得到解離常數(shù)為 31.5 μM。細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（cellular thermal shift assay，CETSA）和藥物親和響應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（DARTS）進(jìn)一步證明了 CTS 與 ENO1 的結(jié)合能力。

研究者使用 ENO1 特異性抗體從細(xì)胞裂解液中捕獲 ENO1 蛋白，從而檢測細(xì)胞內(nèi) ENO1 特異性酶活性。結(jié)果顯示，CTS 可顯著降低 AGS 和 HGC-27 胃癌細(xì)胞中的 ENO1 活性。隨后，研究者在 AGS 細(xì)胞中敲低 ENO1 蛋白水平。與野生型細(xì)胞相比，在 ENO1 缺失的 AGS 細(xì)胞中，CTS 對乳酸生成的抑制作用顯著減弱，同時其對總烯醇化酶活性的抑制也下降。這些結(jié)果表明，CTS 可作為烯醇化酶抑制劑，主要通過抑制 ENO1 酶活性發(fā)揮降低乳酸生成的作用。

圖2：CTS 被鑒定為烯醇化酶抑制劑。（A）基于 ENO1 結(jié)構(gòu)的高通量化合物篩選。（B）不同化合物對 HGC-27 細(xì)胞乳酸分泌的抑制率。（C）LiP-MS 示意圖。（D）LiP-MS 鑒定到的 ENO 肽段豐度統(tǒng)計。（E–F）ENO1 與 CTS 之間的 SPR 分析。（G）基于 AGS 細(xì)胞裂解液的 CETSA 和 DARTS 實(shí)驗(yàn)。（H，I）CTS 處理 24 h 后，檢測胃癌細(xì)胞中的 ENO1 酶活性。（J）AGS 細(xì)胞中敲低 ENO1 表達(dá)后的 Western blot 圖像。（K）檢測 ENO1 敲低 AGS 細(xì)胞培養(yǎng)上清中的乳酸水平。（L）檢測 ENO1 敲低 AGS 細(xì)胞裂解液中的烯醇化酶活性。原圖中包含 ns、、* 及具體 P 值等統(tǒng)計學(xué)標(biāo)記。

CTS 抑制胃癌細(xì)胞惡性表型

研究者首先通過 CCK-8 實(shí)驗(yàn)評估 CTS 對胃癌細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果顯示，CTS 對 AGS 和 HGC-27 細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為 11.88 μM 和 17.92 μM。胃癌細(xì)胞暴露于特定濃度 CTS 24 h 后，增殖能力顯著下降。同時，CTS 明顯降低胃癌細(xì)胞中增殖標(biāo)志物 Ki67 和 PCNA 的表達(dá)。

CTS 對胃癌細(xì)胞的促凋亡作用主要出現(xiàn)在較高濃度持續(xù)暴露條件下。在 4–8 μM 濃度范圍內(nèi)，胃癌細(xì)胞凋亡率約為 5%–10%；而 16 μM CTS 可顯著增加凋亡。同時，CTS 暴露誘導(dǎo)凋亡標(biāo)志物 Caspase-3 剪切，提示凋亡通路被啟動。通過無標(biāo)記延時成像，研究者在 12 h 內(nèi)追蹤細(xì)胞運(yùn)動軌跡，發(fā)現(xiàn) CTS 可顯著抑制胃癌細(xì)胞遷移，且這一效應(yīng)在給藥后較快出現(xiàn)。

隨后，研究者將 AGS 和 HGC-27 細(xì)胞形成的腫瘤球嵌入三維基質(zhì)膠中，并進(jìn)行 72 h 延時成像，以觀察其侵襲表型。結(jié)果顯示，CTS 以濃度依賴方式顯著抑制胃癌細(xì)胞在基質(zhì)膠中的侵襲能力。這些結(jié)果表明，CTS 可抑制胃癌細(xì)胞的多種惡性表型。

圖3：CTS 抑制胃癌中的惡性表型。（A）CTS 處理 24 h 后，通過 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞活力。（B）CTS 處理 24 h 后，通過 EdU 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖；原圖顯示 DAPI、EdU 和 Merge 通道。（C）細(xì)胞增殖標(biāo)志物的 Western blot 圖像。（D）CTS 處理 24 h 后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌細(xì)胞凋亡；原圖標(biāo)注 Annexin V-FITC 和 PI 通道。（E）凋亡標(biāo)志物的 Western blot 圖像。（F）使用高內(nèi)涵實(shí)時成像系統(tǒng)追蹤 12 h 的細(xì)胞運(yùn)動軌跡。（G）通過三維侵襲實(shí)驗(yàn)評估胃癌細(xì)胞侵襲表型。原圖中包含 ns、、* 等統(tǒng)計學(xué)標(biāo)記。

CTS 通過抑制乳酸影響胃癌細(xì)胞功能

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，CTS 可劑量依賴性抑制胃癌細(xì)胞乳酸生成。與此同時，向培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的外源性 L-乳酸可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞活性。含 15 mM 乳酸的培養(yǎng)基在室溫下 pH 為 5.94。隨后，研究者使用鹽酸將培養(yǎng)基 pH 調(diào)整至 5.9。在該條件下培養(yǎng)細(xì)胞 24 h，會輕度損傷胃癌細(xì)胞活力。因此，外源性乳酸引起的促增殖作用主要來自乳酸本身，而不是由細(xì)胞外酸性環(huán)境介導(dǎo)。

糖酵解壓力測試顯示，CTS 可劑量依賴性顯著抑制胃癌細(xì)胞的細(xì)胞外酸化率。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CTS 顯著抑制胃癌細(xì)胞的基礎(chǔ)糖酵解和最大糖酵解能力，但對糖酵解儲備影響不明顯。隨后研究者發(fā)現(xiàn)，在 CTS 處理的胃癌細(xì)胞中加入乳酸，可恢復(fù)其增殖能力。這些結(jié)果提示，CTS 抑制胃癌細(xì)胞的能力可能與其抑制乳酸生成的特性相關(guān)。

圖4：CTS 通過乳酸抑制胃癌細(xì)胞。（A）CTS 處理 24 h 后，檢測胃癌細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸水平。（B）加入不同濃度外源性乳酸 24 h 后，通過 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞活力。（C–D）CTS 處理 24 h 后，通過 Seahorse 系統(tǒng)檢測細(xì)胞外酸化率。（E–F）胃癌細(xì)胞中乳酸與 CTS 共同處理 24 h 后，通過 EdU 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖率；原圖顯示 DAPI、EdU 和 Merge 通道。原圖中包含 ns、、、 等統(tǒng)計學(xué)標(biāo)記。

CTS 抑制異種移植瘤和患者來源類器官生長

為評估 CTS 在體內(nèi)抑制胃癌生長的潛力，研究者使用 HGC-27 細(xì)胞建立異種移植瘤模型。結(jié)果顯示，CTS 可劑量依賴性減緩腫瘤生長。值得注意的是，高濃度 CTS 對胃癌的治療效果僅略低于陽性對照藥物順鉑。腫瘤生長曲線顯示，CTS 在開始給藥后即對胃癌進(jìn)展產(chǎn)生抑制作用。同時，CTS 顯著增加異種移植瘤中凋亡標(biāo)志物 Cleaved Caspase-3 的表達(dá)，并降低增殖標(biāo)志物 Ki67 的表達(dá)，說明 CTS 可在體內(nèi)抑制胃癌進(jìn)展。

隨后，研究者對中劑量組和高劑量組小鼠的重要器官進(jìn)行 HE 染色，并由專業(yè)病理學(xué)醫(yī)師評估。結(jié)果顯示，CTS 處理后小鼠器官未見明顯病理改變。給藥最后一天檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平，未觀察到顯著變化。血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）水平也未發(fā)生明顯改變。這些發(fā)現(xiàn)提示，治療濃度下的 CTS 未在小鼠中誘導(dǎo)明顯毒理學(xué)反應(yīng)。

圖5：CTS 抑制異種移植瘤生長。（A）解剖后的異種移植瘤圖像；原圖中可見 2 cm 標(biāo)尺。（B–C）小鼠腫瘤體積和腫瘤重量統(tǒng)計。（D）腫瘤免疫組織化學(xué)圖像，檢測 Cleaved Caspase-3 和 Ki67。（E）CTS 處理兩周后，采集小鼠重要器官并進(jìn)行 HE 染色。（F–G）CTS 處理兩周后，采集小鼠血清并分析多項(xiàng)生化指標(biāo)；圖中還包括 BUN 和 CREA 水平檢測。原圖中包含 、、 等統(tǒng)計學(xué)標(biāo)記。

為了更好評估 CTS 在人源腫瘤中的潛力，研究者建立了來自胃體腺癌患者的人源胃癌類器官。該患者分期為 T4aN2M1。研究者通過延時成像監(jiān)測患者來源類器官在不同藥物暴露 72 h 內(nèi)的變化。結(jié)果顯示，CTS 以劑量依賴方式抑制 PDOs 生長，在高濃度組可觀察到類器官凋亡。研究者還發(fā)現(xiàn)，乳酸可促進(jìn)類器官生長；關(guān)鍵的是，補(bǔ)充乳酸可恢復(fù) CTS 對 PDOs 的抑制作用。CTS 還降低類器官向培養(yǎng)基中分泌乳酸，進(jìn)一步證實(shí)其作為乳酸抑制劑的作用。

第二個類器官來自同源重組修復(fù)缺陷型胃癌，攜帶 ATM 和 ATR 突變，分期為 T4aN+M1。病理檢查顯示其為印戒細(xì)胞癌，并呈現(xiàn)葡萄樣生長模式。與 10 μM 順鉑相比，CTS 對該類器官顯示出更強(qiáng)的抑制作用。乳酸添加明顯促進(jìn)該類器官生長，并可恢復(fù)被 CTS 抑制的生長。同時，CTS 也抑制該類器官的乳酸生成。由于其生長形態(tài)不規(guī)則，研究者未測量該類器官直徑。

第三個珍珠樣類器官來自一名 T4aN+M1 患者，并具有 HER2 陽性分子特征。CTS 顯著抑制其生長，其中 16 μM CTS 的抑制效果與 10 μM 順鉑相當(dāng)。CTS 在抑制乳酸生成方面也表現(xiàn)出較強(qiáng)效應(yīng)。總體來看，這些結(jié)果說明 CTS 可抑制患者來源類器官生長，而這一作用與乳酸抑制相關(guān)。

圖6：CTS 抑制患者來源類器官生長。（A）患者來源胃癌類器官的實(shí)時監(jiān)測圖像；對胃癌類器官大小和活性進(jìn)行評估；CTS 處理 72 h 后，檢測類器官培養(yǎng)基中的乳酸含量。（B–C）患者來源胃癌類器官的實(shí)時監(jiān)測圖像；對胃癌類器官大小和活性進(jìn)行評估；CTS 處理 72 h 后，檢測類器官培養(yǎng)基中的乳酸含量。原圖中包含 Ctrl、CTS、DDP、Lac、CTS+Lac 等處理組，以及 ns、、、 等統(tǒng)計學(xué)標(biāo)記。

CTS 作為 ENO1 的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用

已有研究提示，烯醇化酶的活性單位是二聚體而非單體。為闡明 CTS 通過 ENO1 抑制糖酵解的具體機(jī)制，研究者利用 AlphaFold 2 構(gòu)建 ENO1、ENO2 和 ENO3 的同源二聚體。分子對接分析顯示，CTS 可與 ENO1、ENO2 和 ENO3 二聚體形成明確復(fù)合物。值得注意的是，其結(jié)合位點(diǎn)位于烯醇化酶二聚體形成的裂隙中，該區(qū)域構(gòu)成酶的催化口袋。

隨后，研究者以 ENO1 為代表進(jìn)行 200 ns 分子動力學(xué)模擬。每 1 ns 疊加一次分子構(gòu)象圖，結(jié)果顯示構(gòu)象整體較為一致，提示 CTS 可與 ENO1 形成穩(wěn)定復(fù)合物。均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）分析顯示，CTS 和 ENO1 在 60 ns 后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定平臺期，說明體系達(dá)到熱力學(xué)平衡，CTS-ENO1 復(fù)合物處于穩(wěn)定狀態(tài)。均方根波動（root mean square fluctuation，RMSF）用于評估模擬過程中氨基酸殘基原子坐標(biāo)波動。絕大多數(shù)模擬時間內(nèi) RMSF 值低于 0.2 nm，提示復(fù)合物柔性較低、構(gòu)象穩(wěn)定。同時，ENO1 的二級結(jié)構(gòu)在模擬過程中未發(fā)生明顯變化。后續(xù)自由能分析顯示，體系形成明顯能量簇，提示存在有利結(jié)合區(qū)域。

將 ENO1 天然底物 2-PG 的分子構(gòu)象投射到其結(jié)合口袋后發(fā)現(xiàn)，CTS 與 2-PG 之間并無明顯空間競爭，唯一潛在相互作用可能涉及 Arg32。隨后，在 HGC-27 細(xì)胞裂解液樣本中外源性加入高濃度 2-PG，結(jié)果顯示 CTS 與 2-PG 之間存在復(fù)雜競爭動力學(xué)曲線。低濃度 CTS 時，曲線表現(xiàn)出非競爭性特征；高濃度 CTS 時，則表現(xiàn)出競爭性動力學(xué)特征。這種復(fù)雜動力學(xué)曲線可能源于 CTS 與 Arg32 結(jié)合后降低 ENO2 對 2-PG 的親和力，從而呈現(xiàn)競爭性動力學(xué)表現(xiàn)。然而，此處使用的 CTS 濃度遠(yuǎn)高于細(xì)胞暴露水平，因此研究者認(rèn)為 CTS 對 ENO 活性的抑制主要通過變構(gòu)調(diào)控實(shí)現(xiàn)。

最后，為判斷 CTS 與 ENO1 結(jié)合是否依賴 Thr379 位點(diǎn)，研究者構(gòu)建了 ENO1 T379A 突變體。他們在無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá) His-ENO1 T379A，并通過鈷柱色譜純化蛋白。SPR 分析顯示，ENO1 T379A 與 CTS 的解離常數(shù)為 164.4 μM，結(jié)合強(qiáng)度下降約 5 倍。這些結(jié)果說明，ENO1 的 Thr379 是其與 CTS 相互作用的關(guān)鍵氨基酸。

圖7：CTS 作為 ENO1 的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用。（A）ENO1、ENO2 和 ENO3 同源二聚體與 CTS 的分子對接。（B）分子動力學(xué)模擬過程中 200 個構(gòu)象的疊加圖像。（C–D）動力學(xué)模擬的 RMSD 和 RMSF 分析。（E）蛋白二級結(jié)構(gòu)分析。（F）動力學(xué)模擬過程中結(jié)合能的三維可視化。（G）CTS 和 2-PG 在 ENO1 二聚體結(jié)合口袋中的位置和構(gòu)象。（H）CTS 與 2-PG 的競爭動力學(xué)曲線。（I）純化 ENO1 T379A 的考馬斯亮藍(lán)染色凝膠。（J–K）ENO1 T379A 與 CTS 的 SPR 分析。

CTS 抑制組蛋白 H3 乳酰化

近期研究顯示，蛋白賴氨酸乳酰化在腫瘤進(jìn)展中具有重要作用，尤其與轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)，CTS 可顯著抑制 AGS 細(xì)胞中全局賴氨酸乳酰化水平，這可能與乳酸含量降低直接相關(guān)。值得注意的是，在約 15 kDa 處可觀察到一條明顯乳酰化條帶，并且該條帶被 CTS 顯著下調(diào)。研究者使用考馬斯亮藍(lán)染色定位該條帶，并對該位置凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果檢測到組蛋白 H3 肽段，且其在凝膠中豐度較高。

鑒于組蛋白 H3 第 9、14 和 18 位點(diǎn)乳酰化在腫瘤發(fā)生中具有重要作用，研究者進(jìn)一步檢測 CTS 對這些位點(diǎn)乳酰化的影響。結(jié)果顯示，CTS 以劑量依賴方式降低 H3K9 和 H3K18 乳酰化水平，其中 H3K18 位點(diǎn)下降最為明顯。與此一致，在接受 30 mg/kg CTS 處理的異種移植瘤中，H3K18la 水平也下降。

p300 被認(rèn)為參與 H3K18la 的“寫入”，而 HDAC2 參與其“擦除”。本研究發(fā)現(xiàn)，CTS 并未改變 p300 與 H3 之間的相互作用。胃癌細(xì)胞中 H3K18la 的降低大約需要 CTS 暴露 6 h。因此，研究者檢測了 AGS 細(xì)胞暴露于 CTS 3 h 后，HDAC2 與 H3K18la 蛋白之間的相互作用。結(jié)果顯示，CTS 顯著增加 HDAC2 與 H3K18la 的結(jié)合。

鑒于 PEP 被報道為 HDAC1 抑制劑，研究者推測 PEP 也可能與 HDAC2 結(jié)合，并抑制其去乳酰化活性。分子對接結(jié)果顯示，PEP 可直接結(jié)合 HDAC2，并形成兩個穩(wěn)定氫鍵。隨后，研究者模擬 HDAC2-H3 復(fù)合物構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)二者之間具有廣泛而穩(wěn)定的結(jié)合界面，結(jié)合能為 -22.9 kcal/mol。值得注意的是，PEP 與 HDAC2 的結(jié)合位點(diǎn)位于該界面中，并占據(jù)部分空間。該結(jié)果提示，PEP 可能作為 HDAC2 去乳酰化活性的抑制劑發(fā)揮作用。

因此，研究者提出 CTS 對組蛋白 H3 乳酰化具有雙重抑制作用：一方面，CTS 降低乳酸水平，從而減少總體乳酰化；另一方面，CTS 降低 PEP 水平，從而增強(qiáng) HDAC2 介導(dǎo)的 H3K18la 去乳酰化。

圖8：CTS 抑制組蛋白 H3 乳酰化。（A）HGC-27 細(xì)胞經(jīng) CTS 處理 24 h 后，泛乳酸修飾蛋白的 Western blot 圖像及對應(yīng)考馬斯亮藍(lán)染色凝膠。（B）凝膠 15 kDa 位置處組蛋白 H3 的二級質(zhì)譜圖。（C）組蛋白 H3 第 9、14 和 18 位點(diǎn)修飾的 Western blot 圖像。（D）異種移植瘤中 H3K18la 的免疫組織化學(xué)圖像，比例尺：50 μm。（E）不同條件下 p300 與組蛋白 H3 的共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）圖像。（F）不同 CTS 處理時間后 H3K18la 的 Western blot 圖像。（G）不同條件下 HDAC2 與 H3K18la 的共免疫沉淀圖像。（H）HDAC2 與 PEP 的分子對接圖像。（I–J）HDAC2 與組蛋白 H3 的分子對接圖像。（K）PEP 與 HDAC2 的結(jié)合位點(diǎn)位于 H3 和 HDAC2 之間的界面處。

H3K18la 降低通過下調(diào) MGAT4A 抑制葡萄糖攝取

為研究 H3K18la 下降所調(diào)控的轉(zhuǎn)錄過程，研究者使用 H3K18la 抗體對 HGC-27 細(xì)胞進(jìn)行 Cut&Tag 分析。結(jié)果顯示，在 CTS 處理細(xì)胞中，第 18 位點(diǎn)乳酰化的 H3 蛋白在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcription start site，TSS）區(qū)域的富集顯著降低。在正常條件下，乳酰化 H3 蛋白主要定位于內(nèi)含子、遠(yuǎn)端基因間區(qū)、啟動子和外顯子區(qū)域。

進(jìn)一步分析 CTS 對啟動子區(qū)域乳酰化 H3 富集的調(diào)控后，MGAT4A 的顯著下調(diào)引起研究者關(guān)注。整合基因組瀏覽器（IGV）可視化結(jié)果顯示，CTS 干預(yù)后 MGAT4A 位點(diǎn)的 H3K18la 富集廣泛下降。TCGA 數(shù)據(jù)庫分析顯示，MGAT4A 在多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，尤其是在急性髓系白血病（LAML）、胃腺癌（STAD）和胸腺瘤（THYM）中更為明顯。MGAT4A 已知可通過糖酵解促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，并與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 GLUT1 的細(xì)胞膜定位相關(guān)。

研究者首先通過 Western blot 確認(rèn)，CTS 可降低胃癌細(xì)胞中 MGAT4A 表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示，CTS 處理 24 h 后，GLUT1 在細(xì)胞膜上的定位減少，同時細(xì)胞質(zhì)中 MGAT4A 表達(dá)下降。類似結(jié)果也在異種移植瘤中觀察到：在 CTS 處理的腫瘤區(qū)域中，MGAT4A 低表達(dá)區(qū)域伴隨 GLUT1 細(xì)胞膜定位受損。由于 GLUT1 的膜表達(dá)對葡萄糖攝取功能至關(guān)重要，研究者隨后發(fā)現(xiàn)，CTS 可劑量依賴性減少胃癌細(xì)胞對葡萄糖類似物 2-NBDG 的攝取，提示細(xì)胞葡萄糖攝取受到抑制。

進(jìn)一步地，研究者建立了外源性表達(dá) MGAT4A 的胃癌細(xì)胞系。當(dāng)這些細(xì)胞暴露于 CTS 后，外源性 MGAT4A 表達(dá)可部分恢復(fù)胃癌細(xì)胞的葡萄糖攝取。以上結(jié)果表明，CTS 通過降低 MGAT4A 表達(dá)并減少 GLUT1 細(xì)胞膜定位，抑制胃癌細(xì)胞葡萄糖攝取。

圖9：H3K18la 降低通過減少 MGAT4A 表達(dá)抑制葡萄糖攝取。（A）TSS 區(qū)域 H3K18la 富集圖。（B）H3K18la 在不同 DNA 區(qū)域中的富集比例。（C）CTS 處理前后 DNA 區(qū)域中 H3K18la 差異富集的火山圖。（D）MGAT4A 的 IGV 可視化結(jié)果。（E）TCGA 數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤類型的 MGAT4A 表達(dá)水平分析。（F）CTS 處理 24 h 后 MGAT4A 表達(dá)的 Western blot 圖像。（G）CTS（8 μM）處理 24 h 后，MGAT4A 和 GLUT1 的免疫熒光圖像；原圖顯示 DAPI（藍(lán)色）、MGAT4A（綠色）、GLUT1（紅色）和 Merge 通道。（H）異種移植瘤免疫熒光圖像，比例尺：25 μm；原圖顯示 DAPI（藍(lán)色）、MGAT4A（紅色）、GLUT1（綠色）和 Merge 通道。（I）CTS 處理 24 h 后，胃癌細(xì)胞對葡萄糖類似物 2-NBDG 的葡萄糖攝取率。（J）CTS 暴露 24 h 后，過表達(dá) MGAT4A 的胃癌細(xì)胞系的 Western blot 圖像。（K）采用 2-DG 方法進(jìn)行葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)。原圖中包含 、* 等統(tǒng)計學(xué)標(biāo)記。

【貢獻(xiàn)】★★★★★

總之，本研究較系統(tǒng)地評估了 CTS 在胃癌中抑制組蛋白 H3 乳酰化的作用及機(jī)制，并通過多種技術(shù)手段進(jìn)行了驗(yàn)證。研究結(jié)果支持 CTS 可作為調(diào)控乳酸和乳酰化的有效分子工具，也可能為傳統(tǒng)中藥丹參的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供更多機(jī)制依據(jù)。需要注意的是，本文研究主要基于胃癌細(xì)胞、異種移植瘤和患者來源類器官等模型，其結(jié)果仍屬于機(jī)制和前臨床層面的證據(jù)，不能直接等同于臨床治療效果。

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