細胞治療領域新進展，普瑞基準攜手AI實現生物分析新突破！

近年來，隨著細胞與基因治療（CGT）領域的快速發展，體內細胞治療（in vivo cell therapy）正成為行業矚目的焦點。與傳統體外改造的細胞療法相比，體內細胞治療通過慢病毒、RNA-LNP等遞送系統，直接在患者體內“原位改造”細胞，極大縮短了制備周期、降低了治療成本，為自身免疫病與腫瘤治療帶來了全新可能。

如上圖所示，2025年9月，《柳葉刀》發表了基于慢病毒載體的體內BCMA CAR-T療法治療多發性骨髓瘤的臨床研究結果，同時《新英格蘭醫學雜志》發表全球首項基于mRNA-LNP的體內CAR-T治療紅斑狼瘡的人體臨床研究，這兩項重磅研究代表著目前體內細胞治療的兩大技術策略（慢病毒載體和RNA-LNP）和主流方向，標志著該技術正式從概念走向臨床。值得一提的是，這兩項重磅研究全部是在中國境內主導進行的，也代表著中國醫藥行業在體內細胞治療領域已經處于國際領先地位。

同樣是在2025年09月底，Carl H. June教授聯合一眾細胞治療領域專家在《nature review》雜志上發表“In vivo chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy”綜述，詳細闡述了體內細胞治療的現狀和未來的發展方向。目前慢病毒載體和RNA-LNP（環狀RNA和mRNA等）各有優缺點、各有擅長的疾病領域，未來哪種載體更適合臨床應用需要通過更多的臨床數據來驗證。

體內細胞治療臨床試驗和IIT中涉及的分析指標，除了參考2024年發布的《細胞治療產品臨床藥理學研究技術指導原則(試行)》，還應參照基因治療相關的檢測范疇。我們將從以下兩個主流的體內細胞治療方向（慢病毒和RNA-LNP）來闡述體內細胞治療的生物分析策略。

體內（In-vivo）細胞治療（慢病毒載體）檢測解決方案

細胞動力學/藥代動力學（Pharmacokinetics）

體內細胞治療產品的體內過程是影響有效性和安全性的重要因素，應根據具體產品采用適宜的分析方法考察細胞動力學/藥代動力學特征。慢病毒載體進行體內細胞治療，一般表達效率最高可以達到30-65%甚至更高一些，且會持續長期表達。慢病毒載體的體內細胞治療除了進行體外細胞治療常測的CAR+細胞濃度檢測（通常采用流式細胞術方法檢測）和外源基因拷貝數檢測（通常采用qPCR或dPCR方法檢測）以外，還需要額外增加對于病毒顆粒本身的檢測。常見的慢病毒物理滴度檢測方法包括P24 ELISA法（檢測載體樣本中的p24蛋白）、qPCR法測慢病毒滴度（定量測定血漿中含基因組的慢病毒顆粒）等常用方法，其他新技術檢測病毒顆粒數，如病毒計數儀法、納米顆粒跟蹤分析法、場流分離-多角度激光光散射法等，應關注方法對待測病毒類型的適用性。目前qPCR法以慢病毒載體基因組中的保守區（LTR）為靶標，能夠定量、高靈敏、快速的檢測血漿中的病毒總顆粒數，是目前常用且比較容易搭建的檢測方法。

藥效學 (Pharmacodynamics, PD)

體內細胞治療藥效學的檢測指標，基本上和體外細胞治療是一致的，也是會重點關注生物標志物等藥效學指標。如可通過配體結合試驗（LBA）檢測IL-6、IFNs、TNFs和IL-2等細胞因子來評價T細胞的活化特性。檢測一些特定蛋白的活性、持續時間和變化情況等也可以反映藥效，另外淋巴細胞亞群分析也可對細胞治療產品的有效性提供有意義的數據支持。針對血液系統腫瘤的體內細胞治療產品，血細胞的檢測和監控是免疫細胞治療產品藥效學分析的重要內容。

免疫原性（Immunogenicity）

慢病毒載體進行體內細胞治療，一般認為會穩定轉染免疫細胞并整合到人的基因組中，在體內可以長期存活并表達相應的轉基因產物，其外源組分和表達產物均可能引起免疫反應。 因此，建議對外源組分和表達產物均進行免疫原性檢測方法的開發。如果有共表達產物，關注對共表達產物進行免疫原性檢測方法的開發，在能夠獲得scFv/蛋白/抗體和陽性對照抗體的情況下，常見的開發模式是采用橋連法，能夠特異性的檢測相關的ADA。

除了和體外細胞治療一樣的免疫原性以外，當慢病毒載體回輸到人體內時，針對病毒本身也會產生免疫原性，因此針對慢病毒本身的免疫原性是體內細胞治療要重點考慮的一個方向。一般人體免疫系統產生抗體的最主要、最有效的靶標是病毒顆粒表面的包膜糖蛋白和衣殼蛋白。因此，為了全面的評估針對慢病毒本身的免疫原性，有以下圖中幾種開發策略：

1.采用直接法檢測針對慢病毒的廣譜ADA：把慢病毒顆粒包被在板底，由于慢病毒本身很難進行標記（主要是因為慢病毒的①結構脆弱性：慢病毒的囊膜對物理化學處理敏感，易失活；②靶點稀少與異質性：表面可用于共價標記的化學基團（如賴氨酸的氨基）數量有限且分布不均；③功能敏感性：標記反應容易損傷其感染性所必需的表面糖蛋白（如VSV-G）），所以用anti-human Fc antibody進行檢測，這種方法的優勢是能夠檢測到和慢病毒本身結合的所有抗體ADA，缺點是會產生較多的背景信號，特異性不夠好。或者利用抗體提取和酸解原理，采用親和捕獲洗脫法（ACE）來檢測針對慢病毒本身的所有抗體ADA。

目前體內CAR-T經常會把慢病毒上的包膜蛋白EnV改造成假型化載體（使用VSV-G），人體內產生的抗體主要針對VSV-G蛋白，則需要針對VSV-G蛋白去開發方法。另外，p24是構成慢病毒粒子衣殼的主要結構蛋白，每個病毒顆粒含有約2000個p24蛋白分子。針對p24本身的抗體檢測方法也可以考慮代表慢病毒的免疫原性。

因此直接法的檢測抗體也可以考慮換成標記好的包膜蛋白（VSV-G）或衣殼蛋白（p24），這樣會減少很多背景信號。

2.如上文所述，也可以采用針對包膜蛋白VSV-G和針對衣殼蛋白p24進行ADA檢測，這兩個蛋白的ADA目前認為在一定程度上也能夠代表針對慢病毒的免疫原性，優勢是檢測方法特異性更好，缺點是可能無法完全表征針對慢病毒的全部抗體。

3.如下圖所示，目前為了使體內細胞療法更具有靶向性，能夠特異性的轉染體內的免疫細胞。一般都會在慢病毒表面偶聯一些特異性的抗體，比如CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等，人體針對這些偶聯抗體可能也會產生一定的免疫原性，雖然針對這些免疫標記物抗體的免疫原性可能會極低，建議前期進行研究的時候也可以充分和全面的考慮，避免漏掉一些信息。

安全性檢測（Safety）

以慢病毒為載體的體內細胞療法和體外細胞療法，都會關注的是：慢病毒載體因其可整合靶細胞基因組的特性，對其安全性監管的重點主要集中在可復制性慢病毒與載體插入位點的檢測。普瑞基準已經自主研發了一套高效的慢病毒復制型病毒（RCL）檢測和慢病毒整合位點（ISA）檢測方法，如VSV-G QPCR法檢測包膜基因核酸片段、p24結構蛋白檢測法，以及NGS平臺檢測ISA的方法，目前這些方法都用于注冊臨床試驗中的樣本檢測。

對于體內細胞療法，可能還需要額外關注脫靶風險，比如非T細胞轉導可能引發毒性（如肝毒性），普瑞基準在脫靶檢測評估方面依托公司強大的AI+生信分析能力，為不同的細胞治療產品提供全面精準的評估。

體內（In-vivo）細胞治療（靶向脂質納米顆粒（tLNPs））檢測解決方案

細胞動力學/藥代動力學（Pharmacokinetics）

靶向脂質納米顆粒（tLNPs）的體內細胞治療，除了進行體外細胞治療常測的CAR+細胞濃度檢測和外源基因拷貝數/mRNA檢測以外，如果需要額外關注脂質納米顆粒在人體內的濃度變化、分布和清除過程，則需要采用LC-MS/MS等技術進行及時檢測。脂質納米顆粒的PK特性與傳統藥物不同，主要表現為快速組織分布、緩慢消除和肝/腎清除特征。早期臨床研究階段如需要探索相關機制，可以考慮進行全面的藥代動力學分析。

靶向脂質納米顆粒（tLNPs）的體內細胞治療的表達效率一般會比慢病毒載體的低一些，比如遞送物質如果是mRNA的話，CAR表達可能僅能持續2-3天，目前很多公司也在使用環狀RNA（cRNA）作為遞送物質，CAR表達能夠延長至5-10天。RNA-LNP體內細胞治療的愿景是既能獲得持久、高效的蛋白表達，又無需永久性改變細胞基因組。

藥效學 (Pharmacodynamics, PD)

靶向脂質納米顆粒（tLNPs）的體內細胞治療的藥效學檢測指標基本上和上述的慢病毒載體體內細胞治療一樣的，此處不再贅述。

免疫原性（Immunogenicity）

靶向脂質納米顆粒（tLNPs）的體內細胞治療，也需要對外源組分和表達產物均進行免疫原性檢測方法的開發。開發方法和體外細胞治療一樣，比如需要針對scFv進行ADA檢測。

除了和體外細胞治療一樣的免疫原性以外，由于tLNPs作為載體回輸到人體內時，不會使mRNA整合到細胞基因組，而是短暫表達，因此需要多次給藥，并且為了使表達效率提高，目前的給藥劑量也較大，所以人體還是會產生一定的免疫原性。目前常用的LNP載體通常認為是免疫原性很低的載體，以LNP本身制備ADA陽性對照（Positive control）比較困難，一般情況下不考察LNP總體的免疫原性。但是值得注意的是LNP上通常有PEG脂質，其中的PEG修飾成分是潛在的引起免疫原性的物質，并且機體可能存在預存anti-PEG抗體（pre-existing anti-PEG antibodies）也會造成藥物清除速度加快等情況。因此通常對于LNP載體的mRNA藥物，會建議考察其PEG成分的免疫原性。針對脂質納米顆粒的PEG2000成分，血液樣本的ADA檢測應該能夠檢測到IgG和IgM亞型，可以考慮檢測抗PEG IgM和IgG來全面考察針對PEG的ADA。

如下圖所示，和慢病毒載體類似的，目前為了使體內細胞療法更具有靶向性，能夠特異性的轉染體內的免疫細胞。一般都會在LNP表面偶聯一些特異性的抗體，比如CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等，人體針對這些偶聯抗體可能也會產生一定的免疫原性，考慮和檢測方法和上文慢病毒載體的類似，此處不做進一步贅述。

安全性檢測（Safety）

目前普遍認為脂質納米顆粒（LNP）的安全性是優于慢病毒載體的，主要是mRNA等轉染細胞后是瞬時表達，無插入突變風險。這一技術在COVID-19疫苗中得到了史無前例的驗證，其高效、安全、可規模化的特性，使其成為in vivo CAR-T領域最具潛力的候選者。

對于靶向脂質納米顆粒（tLNPs）的體內細胞治療，也需要額外關注脫靶風險，此處是和慢病毒載體比較類似，。

結語

在目前的體內細胞治療前沿領域，普瑞基準公司憑借深厚的中心實驗室平臺與多組學技術積累，為藥企提供從方法開發到臨床檢測的全流程生物分析解決方案，助力體內細胞治療從實驗室走向患者。然而，這類新型療法的臨床開發離不開精準、合規的生物分析支持。從藥代動力學到免疫原性，從安全性到生物標志物，每一個環節都需嚴格驗證與標準化檢測。普瑞基準是國內為數不多擁有雙“C”認證（CAP+CLIA）的實驗室，其質量體系不僅能夠滿足國內臨床試驗對于中心實驗室的要求，也承接了很多國際多中心臨床試驗（MRCT）項目。

體內細胞治療正在重塑未來醫藥的格局。普瑞基準愿與行業伙伴攜手，以精準、可靠、高效的生物分析服務，共同推動更多創新療法早日惠及患者，助力中國CGT走向世界前沿。

作為一家以“多組學+數據挖掘”為特色的新型平臺公司，普瑞基準在細胞與基因治療領域已積累了豐富的項目經驗。公司在北京與蘇州設有中心實驗室，配備流式細胞儀、qPCR/dPCR、MSD、NGS、單細胞測序等先進平臺，可為藥企提供符合NMPA/FDA要求的生物分析服務。

【關于普瑞基準】

普瑞基準是一家以“多組學+AI”驅動，專注于創新藥轉化醫學研發服務的新型平臺公司。公司為藥企提供全球領先水準的生物標志物發現、基于生物標志物的新藥臨床差異化開發策略、中心實驗室檢測、藥物伴隨診斷開發等服務。目前已與多家國內外領先的藥企及生物科技公司形成深度合作，助力多個新藥的研發和獲批。同時，公司也在臨床端與合作的藥企、醫生一道為患者提供先進、精準的檢測產品，助力精準檢測的臨床實踐。（文章來源于：公眾號普瑞基準）

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