乳酸菌是一種無(wú)孢子的革蘭氏陽(yáng)性菌，大部分乳酸菌具有益生功能，可以產(chǎn)生大量活性肽、細(xì)菌素、胞外多糖等活性物質(zhì)，也可以促進(jìn)人體健康，具有改善非特異性腸道黏膜完整性、抗氧化、降血糖、降血脂、降尿酸、免疫調(diào)節(jié)等功能特性，被廣泛應(yīng)用于食品、功能性產(chǎn)品中。

冷凍干燥是企業(yè)目前最常用的加工手段，在冷凍干燥過(guò)程中，菌株處于真空、低溫的環(huán)境，可有效避免因氧化和高溫造成的損傷，維持菌株的生理活性和遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性，所制備的菌粉活菌數(shù)較高；但冷凍干燥不能連續(xù)生產(chǎn)，且周期長(zhǎng)、能耗大、成本高，這限制了冷凍干燥制備菌粉的商業(yè)化發(fā)展；通過(guò)噴霧干燥的手段可以高效快速的制備乳酸菌菌粉，并且噴霧干燥制備菌粉的方法可實(shí)現(xiàn)連續(xù)性生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短、能耗小、成本低，然而噴霧干燥時(shí)的溫度較高會(huì)損傷乳酸菌細(xì)胞，降低菌株存活率，盡管通過(guò)低溫噴霧干燥可以降低高溫對(duì)菌株造成的損失，但該方法制備的乳酸菌菌粉含水量較高，不易貯藏，同時(shí)低溫噴霧干燥能耗高、效率低；因此，如何解決噴霧干燥過(guò)程中乳酸菌細(xì)胞損傷大、存活率低的問(wèn)題是目前研究的焦點(diǎn)。

為解決此問(wèn)題，研究發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)選擇合適的壁材進(jìn)行微膠囊包埋或添加保護(hù)劑的方法保護(hù)乳酸菌，減輕菌株細(xì)胞在噴霧干燥過(guò)程中的損傷。但微膠囊包埋的方法對(duì)壁材要求較高且工藝操作復(fù)雜，同時(shí)成本較高，很難應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)；添加保護(hù)劑的方法也存在一定的局限性，保護(hù)劑的篩選過(guò)程耗時(shí)耗力，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)有效保護(hù)需要大量添加，費(fèi)用昂貴，且保護(hù)劑受菌株特異性影響，保護(hù)機(jī)制不一，使其作用結(jié)果難以預(yù)測(cè)，可能導(dǎo)致存活率降低；研究表明通過(guò)應(yīng)激處理的方式，如熱應(yīng)激、冷應(yīng)激等可以激活菌株的自我保護(hù)機(jī)制，產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，改變細(xì)胞膜脂肪酸的組成，使乳酸菌在噴霧干燥時(shí)保持較高的細(xì)胞膜完整性，進(jìn)而提高噴霧干燥下的存活率。因此，通過(guò)應(yīng)激處理提高乳酸菌噴霧干燥抗性逐漸成為研究熱點(diǎn)。

海藻糖作為一種天然保護(hù)劑，可以提高乳酸菌耐高溫、抗氧化、抗脫水的能力，改善乳酸菌的噴霧干燥抗性；大量研究表明將海藻糖導(dǎo)入乳酸菌菌體內(nèi)，可以極顯著提升乳酸菌噴霧干燥的抗性，但如何高效地導(dǎo)入是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院的任文榮、王俊國(guó)*系統(tǒng)綜述如何利用應(yīng)激處理以及通過(guò)應(yīng)激處理將外源海藻糖導(dǎo)入乳酸菌細(xì)胞內(nèi)的方法，從而提高乳酸菌噴霧干燥的抗性，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步分析，旨在為乳酸菌菌粉的工業(yè)化生產(chǎn)及其貯藏穩(wěn)定性的提高奠定理論基礎(chǔ)。

1

噴霧干燥下乳酸菌死亡的主要原因

在噴霧干燥過(guò)程中，菌株面臨著高溫、脫水、氧化、滲透壓升高等不利因素，會(huì)造成菌株損傷甚至死亡（圖1）。

1.1 高溫

噴霧干燥過(guò)程中的高溫會(huì)對(duì)菌株的結(jié)構(gòu)和組分（如細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、核糖體、RNA、DNA、蛋白質(zhì)以及酶等）產(chǎn)生影響，其中細(xì)胞壁最容易受溫度影響。Santivarangkna等的研究表明，雖然噴霧干燥時(shí)進(jìn)口溫度很高，但對(duì)菌株的影響輕微，出口溫度才是導(dǎo)致乳酸菌熱失活的主要因素，一般該溫度在60～75 ℃。不同乳酸菌的熱敏感性不同，但大部分乳酸菌在50 ℃以上時(shí)易受損傷；Teixeira等研究發(fā)現(xiàn)，50 ℃左右對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷，60 ℃左右對(duì)核糖體的30S亞基產(chǎn)生損傷，65 ℃蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生熱變性；64 ℃以下時(shí)，乳酸菌熱致死的主要原因是細(xì)胞膜損傷；65 ℃以上時(shí)，乳酸菌熱致死的主要原因則是核糖體、蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁的損傷，其中核糖體損傷不可逆，被認(rèn)為是乳酸菌熱致死的關(guān)鍵因素。

1.2 脫水

脫水也是造成細(xì)胞膜損傷使乳酸菌死亡的一個(gè)重要原因。Peighambardoust等研究發(fā)現(xiàn)，噴霧干燥過(guò)程中，水分的快速蒸發(fā)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜表面水合層喪失，這增強(qiáng)了分子間的靜電相互作用和范德華力，脂質(zhì)分子被大幅度橫向拉扯，導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層在橫向平面內(nèi)的應(yīng)力增大，破壞了其維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的平衡距離，造成膜結(jié)構(gòu)的緊繃、脆弱，甚至凹陷或破裂，最終導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)泄漏；除此之外，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生明顯的相變，從具有流動(dòng)性的液晶相轉(zhuǎn)變?yōu)閯傂愿鼜?qiáng)的凝膠相，這一現(xiàn)象直接導(dǎo)致膜流動(dòng)性的喪失，成為引起乳酸菌死亡的重要原因；更關(guān)鍵的是，脫水作用還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜雙分子層結(jié)構(gòu)的根本性改變，為了減少高能量的非極性狀態(tài)，在缺水環(huán)境下，磷脂分子不再維持“頭向外、尾向內(nèi)”的雙分子層結(jié)構(gòu)，而是重新排列，極性頭部基團(tuán)相互聚集形成極性內(nèi)核，疏水性尾部則向外伸展，形成反向六角相結(jié)構(gòu)，以避開(kāi)不利的水環(huán)境，這種結(jié)構(gòu)重組顯著改變了細(xì)胞膜的通透性（圖2）。Gong Pimin等研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重脫水甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)的泄漏以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的塌陷和破裂；這些結(jié)構(gòu)損傷最終可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞失去活性。

1.3 氧化

噴霧干燥過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧也會(huì)對(duì)乳酸菌產(chǎn)生多重?fù)p傷。活性氧能夠與核酸、蛋白質(zhì)及細(xì)胞膜等生物大分子結(jié)合，進(jìn)而引發(fā)顯著的細(xì)胞損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化物則可通過(guò)氧化作用導(dǎo)致細(xì)菌DNA損傷，這證實(shí)了氧化應(yīng)激是導(dǎo)致菌體死亡的關(guān)鍵因素之一。Dijkstra等的研究表明，在正常生理狀態(tài)下，乳酸菌自身能夠合成抗氧化酶，清除環(huán)境中的活性氧，維持氧化還原平衡，但在干燥過(guò)程中，乳酸菌自身正常代謝活動(dòng)受到限制，菌株抗氧化能力下降，活性氧大量積累，使DNA突變，核苷酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等分子的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡；值得注意的是，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，由活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞膜氧化損傷也是造成菌株在后續(xù)貯藏階段存活率持續(xù)下降的主要原因。

除氧化損傷外，噴霧干燥過(guò)程中的物理應(yīng)力也對(duì)菌體存活率有很大影響，在霧化階段產(chǎn)生的高強(qiáng)度剪切力以及干燥過(guò)程中滲透壓的急劇升高，均可引起乳酸菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不可逆變化，最終導(dǎo)致菌體死亡，這些復(fù)合應(yīng)激因素的協(xié)同作用顯著降低了噴霧干燥后乳酸菌的存活率。

2

不同應(yīng)激處理對(duì)乳酸菌噴霧干燥抗性的影響

噴霧干燥前對(duì)乳酸菌進(jìn)行適度的亞致死應(yīng)激處理，激活細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)機(jī)制，以增強(qiáng)噴霧干燥時(shí)的抵抗能力，是提高其存活率的一種常用預(yù)處理方式，不同應(yīng)激處理之間可以發(fā)生重疊，形成交叉保護(hù)網(wǎng)絡(luò)，有利于提高菌株對(duì)不利條件的抗性（圖3），常用的應(yīng)激處理方法包括熱應(yīng)激、熱激-修復(fù)、冷應(yīng)激、交叉應(yīng)激等。

2.1 熱應(yīng)激

為解決噴霧干燥過(guò)程中菌株存活率低及貯藏穩(wěn)定性差的問(wèn)題，熱應(yīng)激的預(yù)處理方法已被證實(shí)是一種可以顯著提高乳酸菌噴霧干燥耐受性的有效策略，該方法通過(guò)適宜的溫度激活菌株的自我保護(hù)機(jī)制，從而增強(qiáng)菌株在噴霧干燥過(guò)程中的抵抗能力。

在分子機(jī)制方面，熱應(yīng)激使分子伴侶蛋白含量顯著提高。張臣臣和Chen Mingju等分別將鼠李糖乳酪桿菌hsryfm 1301在噴霧干燥前置于46 ℃條件下進(jìn)行1 h熱處理，將馬乳酒樣乳桿菌M1在噴霧干燥前置于37 ℃熱處理1 h，研究均證實(shí)，鼠李糖乳酪桿菌hsryfm 1301和馬乳酒樣乳桿菌M1經(jīng)熱應(yīng)激后，熱休克蛋白（DnaK、GroEL）和酪蛋白水解蛋白酶X（ClpX）的表達(dá)量顯著增加，這些蛋白與輔助蛋白協(xié)同作用，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，修復(fù)因?yàn)闊釗p傷和脫水而錯(cuò)誤折疊的多肽，降解損傷蛋白，促進(jìn)細(xì)胞存活；同時(shí)參與碳水化合物、氨基酸和核苷酸代謝，維持胞內(nèi)pH值平衡、轉(zhuǎn)錄、翻譯的蛋白質(zhì)表達(dá)量也顯著增加，表明了熱應(yīng)激使菌株耐熱性提高，并對(duì)細(xì)胞代謝狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整，使其轉(zhuǎn)向應(yīng)激防御模式，為菌株抵抗不利條件提供足夠的能量與物質(zhì)基礎(chǔ)。

在膜系統(tǒng)適應(yīng)性調(diào)控機(jī)制方面，熱應(yīng)激重塑了細(xì)胞膜脂質(zhì)的組成。Ma Jiage等對(duì)植物乳植桿菌KLDS 1.0628進(jìn)行45 ℃、1 h的熱處理，結(jié)果表明細(xì)胞膜脂肪酸的組成發(fā)生變化，不飽和脂肪酸比例顯著提升，環(huán)丙烷脂肪酸的含量也顯著增加，使細(xì)胞膜的相變溫度降低，進(jìn)而增強(qiáng)了其在高溫下的流動(dòng)性，避免了因細(xì)胞膜固化而導(dǎo)致的破裂，進(jìn)一步提高了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；此外，環(huán)丙烷脂肪酸含量的增加，也更有效地發(fā)揮了保護(hù)質(zhì)子流和維持pH值穩(wěn)態(tài)的作用，防止菌株在噴霧干燥過(guò)程中的過(guò)度脫水和高溫引發(fā)的質(zhì)子泄漏和離子失衡，從而提高菌株的存活率。

上述機(jī)制的協(xié)同作用可以顯著提高乳酸菌的抗性，進(jìn)而提高乳酸菌在噴霧干燥過(guò)程中的存活率，為提高乳酸菌制劑的生產(chǎn)效率提供了有效途徑。

2.2 熱激-修復(fù)

通過(guò)熱應(yīng)激處理的方法可以提高乳酸菌的噴霧干燥抗性，但本團(tuán)隊(duì)在研究熱應(yīng)激的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，雖然熱應(yīng)激處理提高了菌株的噴霧干燥抗性，但同時(shí)也對(duì)菌株的細(xì)胞膜造成了明顯損傷，進(jìn)而降低了存活率；為此本團(tuán)隊(duì)研究了熱激-修復(fù)的處理方式，在熱應(yīng)激后，于略低于菌株最適生長(zhǎng)的溫度條件下對(duì)其進(jìn)行一段時(shí)間的修復(fù)，延長(zhǎng)應(yīng)激蛋白的作用時(shí)間，從而減少了細(xì)胞膜的損傷，更好地提高乳酸菌的存活率。

植物乳植桿菌LIP-1作為一株高降膽固醇、耐胃酸、耐膽鹽的菌株，具有很大的商業(yè)價(jià)值，對(duì)植物乳植桿菌LIP-1進(jìn)行了熱激-修復(fù)處理，將培養(yǎng)至18 h的3代植物乳植桿菌LIP-1置于44 ℃水浴鍋中熱處理10 min，取出冰水浴冷卻至室溫后，置于30 ℃水浴鍋中修復(fù)10 min，再次冰水浴冷卻至室溫，在75 ℃熱致死30 s，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)熱激后的植物乳植桿菌LIP-1分子伴侶蛋白相關(guān)的編碼基因DnaJ、DnaK、GroES、GroEL、GrpE的表達(dá)水平顯著上調(diào)，與因熱變性展開(kāi)的錯(cuò)誤蛋白結(jié)合，防止其聚集并維持其正確的重折疊，保證蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；但熱應(yīng)激的溫度高于乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度（37 ℃）會(huì)導(dǎo)致不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例下降，使細(xì)胞膜流動(dòng)性過(guò)大，膜的脆性增加，造成膜結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，易受損傷，而在低于乳酸菌最適生長(zhǎng)的溫度條件下對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)時(shí)間的修復(fù)處理后，可以顯著延長(zhǎng)應(yīng)激蛋白發(fā)揮作用的時(shí)間，使大量飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸，細(xì)胞膜中長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的比例回升，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例提高，細(xì)胞膜磷脂層結(jié)構(gòu)變得更緊湊并保持適度的流動(dòng)性，增加了膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，降低了熱激引起的細(xì)胞膜損傷。Rather等的研究已證實(shí)減輕細(xì)胞膜損傷可以提高耐熱性。故熱激-修復(fù)的方法在提高植物乳植桿菌LIP-1耐熱性方面具有極為顯著的作用。

2.3 冷應(yīng)激

冷應(yīng)激也是一種可以解決菌株在噴霧干燥等高溫或高滲透壓環(huán)境下存活率低的方法，與熱應(yīng)激相比，冷應(yīng)激的處理方式更加溫和，避免了高溫對(duì)乳酸菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁造成的損傷，通過(guò)冷應(yīng)激處理可以激活菌株細(xì)胞的一系列轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)在的適應(yīng)性響應(yīng)，顯著增強(qiáng)其抗逆性。

目前，研究表明冷應(yīng)激可以通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵蛋白的表達(dá)與調(diào)整菌株代謝過(guò)程從而增強(qiáng)細(xì)胞穩(wěn)定性。Liu Shaoli等對(duì)植物乳植桿菌K25進(jìn)行冷應(yīng)激處理，發(fā)現(xiàn)菌株所含有的氨甲酰磷酸合酶大亞基、小亞基表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致谷氨酸和谷氨酰胺在胞內(nèi)積累，其作為滲透保護(hù)劑減輕氧化損傷，提高細(xì)胞存活力；參與賴氨酸生物合成的酶表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)肽聚糖的合成，作為細(xì)胞壁的主要骨架結(jié)構(gòu)，肽聚糖合成量的增加增強(qiáng)了細(xì)胞壁完整性，強(qiáng)化了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)；同時(shí)，與DNA修復(fù)、穩(wěn)定等相關(guān)的蛋白表達(dá)也顯著增加，使細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，進(jìn)一步提升了細(xì)胞對(duì)不利條件的抗性。Panoff等對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403進(jìn)行8 ℃、48 h的冷應(yīng)激處理，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Rpod的基因表達(dá)大幅上調(diào)，對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行重編程，使菌株優(yōu)先大量表達(dá)應(yīng)激蛋白和分子伴侶等蛋白，保證蛋白質(zhì)在噴霧干燥過(guò)程中能正確折疊及正常發(fā)揮其功能，提高菌株耐熱性。馬佳歌等還發(fā)現(xiàn)，植物乳植桿菌在低溫應(yīng)激下，LuxS和pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，LuxS的過(guò)表達(dá)與菌株耐熱性的提升直接相關(guān)，其代謝產(chǎn)物AI-2分子也可作為信號(hào)分子，調(diào)控與耐熱性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，在噴霧干燥前啟動(dòng)耐熱程序，進(jìn)一步提高菌株的耐熱性。

同樣地，選取具有高降尿酸功能的副干酪乳酪桿菌LP4進(jìn)行進(jìn)一步的冷應(yīng)激處理研究，將該菌株培養(yǎng)至3代穩(wěn)定期后，置于20 ℃的水浴鍋中冷處理1.5 h。結(jié)果表明，相比于熱應(yīng)激處理，冷應(yīng)激使菌株DNA產(chǎn)生超螺旋結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了DNA的穩(wěn)定性，可以減輕菌株的DNA熱損傷；同時(shí)誘導(dǎo)冷休克蛋白（Csps）的產(chǎn)生，Csps與mRNA結(jié)合起到防止低溫下不利二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的作用，保證轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程正確進(jìn)行；冷應(yīng)激后菌株細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸含量也顯著增加，不飽和脂肪酸的熔點(diǎn)更低，使膜的晶體狀態(tài)發(fā)生改變，保證細(xì)胞膜的流動(dòng)性，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，避免了噴霧干燥時(shí)細(xì)胞膜出現(xiàn)凝膠狀態(tài)；此外，研究還發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激的處理方式不會(huì)對(duì)菌株的細(xì)胞膜造成損傷，冷應(yīng)激后的菌株在高溫下的細(xì)胞壁完整性也更高。

各種機(jī)制的協(xié)同作用使乳酸菌噴霧干燥的耐受性顯著提高，為提高乳酸菌制劑的貯藏穩(wěn)定性提供了有效策略。

2.4 交叉應(yīng)激

目前大多研究都是通過(guò)利用單一應(yīng)激的處理方法提高乳酸菌的抗性，然而單一應(yīng)激的方式并不能系統(tǒng)保護(hù)菌株完整性，其作用效果可能只顯著體現(xiàn)在某一方面。因此，能否通過(guò)交叉應(yīng)激產(chǎn)生協(xié)同作用系統(tǒng)保護(hù)菌株，提高菌株的抗性具有重要的研究?jī)r(jià)值，此外，考慮到應(yīng)激處理會(huì)對(duì)菌株造成一定程度的損傷，在交叉應(yīng)激后對(duì)菌株進(jìn)行修復(fù)處理能否進(jìn)一步提高菌株的噴霧干燥抗性有待進(jìn)一步研究。

本團(tuán)隊(duì)前期選取具有高降尿酸作用的副干酪乳酪桿菌LP4進(jìn)行了進(jìn)一步研究，首次發(fā)現(xiàn)酸冷交叉應(yīng)激-修復(fù)的處理可以更加顯著地提高該菌株的耐熱性。將培養(yǎng)至18 h的3代副干酪乳酪桿菌LP4置于pH 3.5的磷酸鹽緩沖液中，于20 ℃的水浴鍋中處理1.5 h，隨后于35 ℃水浴鍋中修復(fù)15 min，研究表明，修復(fù)處理顯著降低了因酸應(yīng)激而造成的DNA損傷，避免了因DNA損傷過(guò)重而造成的菌株死亡；經(jīng)過(guò)酸冷交叉-修復(fù)處理后，菌株細(xì)胞生物膜的合成量顯著增加，保護(hù)了細(xì)胞膜的完整性，減輕了噴霧干燥時(shí)高溫對(duì)膜的損傷；肽聚糖作為組成細(xì)胞壁網(wǎng)狀骨架結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵成分，通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合表面蛋白，在細(xì)胞壁表面形成保護(hù)屏障，而利用酸冷交叉應(yīng)激-修復(fù)的處理方式顯著增加了細(xì)胞壁中肽聚糖和表面蛋白的含量，使細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度和完整性增加，進(jìn)一步提高菌株對(duì)高溫的抵抗能力。

綜上，交叉應(yīng)激具有協(xié)同作用，可以更顯著地提高菌株耐熱性，進(jìn)而提高菌株噴霧干燥時(shí)的抗性，為高活性乳酸菌制劑的生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

3

海藻糖對(duì)乳酸菌噴霧干燥抗性的影響

大部分糖類在水分含量較低時(shí)會(huì)形成非晶體結(jié)構(gòu)，隨溫度變化轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)，該分子結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，其中，海藻糖的分子結(jié)構(gòu)中具有大量氫鍵的有效位點(diǎn)，可作為蛋白質(zhì)、脂類、微生物細(xì)胞的穩(wěn)定劑，海藻糖在保護(hù)乳酸菌方面同樣優(yōu)勢(shì)顯著；作為一種化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的多羥基非還原性二糖，海藻糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度最高可達(dá)120 ℃，可有效幫助乳酸菌抵抗脫水、高滲透壓、高溫等不利環(huán)境的脅迫；在乳酸菌脫水時(shí)，細(xì)胞膜磷脂雙分子層表面的磷酸可以與海藻糖的羥基相互作用，代替細(xì)胞內(nèi)極性殘基周圍的水分子，從而降低膜相轉(zhuǎn)變溫度，穩(wěn)定磷脂雙分子層和膜蛋白的結(jié)構(gòu)，保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷。此外，噴霧干燥過(guò)程中海藻糖對(duì)乳酸菌的保護(hù)作用主要與“水置換機(jī)制”和“水截留機(jī)制”兩種機(jī)制有關(guān)：海藻糖可以置換水分子，增加干燥層中脂質(zhì)間的距離，保護(hù)益生菌免受外界不利環(huán)境的影響，同時(shí)，還可以在海藻糖與生物系統(tǒng)之間截留一層水，減少脂質(zhì)氧化，維持低溫貯藏下益生菌的活力；海藻糖玻璃態(tài)結(jié)構(gòu)的分子遷移率極低，能夠有效阻隔水分子進(jìn)入基質(zhì)內(nèi)部，從而抑制其吸濕性，利用含海藻糖的阿拉伯膠生產(chǎn)的菌粉水分含量降低，避免了一些微生物的污染和不利的化學(xué)反應(yīng)。因此人們將海藻糖廣泛應(yīng)用于提高乳酸菌噴霧干燥抗性。

3.1 培養(yǎng)基中添加海藻糖對(duì)乳酸菌噴霧干燥抗性的影響

大量研究表明，在培養(yǎng)基中添加海藻糖可以對(duì)乳酸菌起到保護(hù)作用，并延長(zhǎng)乳酸菌菌粉的貨架期。楊友馨和Wang Ruixue等分別對(duì)植物乳植桿菌N2-4和植物乳植桿菌LIP-1進(jìn)行研究，將海藻糖作為碳源添加到MRS培養(yǎng)基中分別對(duì)兩種菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)后的菌株進(jìn)行噴霧干燥，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖在細(xì)胞結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性上發(fā)揮著重要作用：一方面它通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞膜脂質(zhì)組分中長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的合成，提高不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值，降低細(xì)胞膜中脂肪酸的熔點(diǎn)，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性；另一方面，海藻糖的存在顯著提高了胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性及2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)陽(yáng)離子自由基清除能力，降低了噴霧干燥與貯藏期間細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累，緩解了菌株細(xì)胞膜脂肪酸的氧化損傷，維持了膜的完整性。對(duì)于細(xì)胞壁而言，海藻糖促進(jìn)了肽聚糖的生物合成，提高了細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，與更具流動(dòng)性的細(xì)胞膜協(xié)同作用能夠更好地抵御噴霧干燥時(shí)不利環(huán)境的脅迫；此外，海藻糖還可作為代謝調(diào)節(jié)器，通過(guò)增強(qiáng)丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的活性，強(qiáng)化糖酵解通路，促進(jìn)ATP的合成，為菌株生長(zhǎng)增殖和細(xì)胞膜上的質(zhì)子泵提供動(dòng)力，使菌株能夠?qū)麅?nèi)的氫離子高效泵出，從而提高菌株細(xì)胞內(nèi)部的pH值，緩解低pH值環(huán)境對(duì)菌株DNA帶來(lái)的損傷，維持遺傳物質(zhì)的完整性。

上述機(jī)制的協(xié)同作用大幅降低了噴霧干燥對(duì)菌株細(xì)胞膜、細(xì)胞壁及DNA的損傷，從而提高了其噴霧干燥存活率，抗氧化能力的提升也顯著降低了菌株貯藏期間的氧化程度，進(jìn)一步提升了菌株的貯藏穩(wěn)定性（圖4）。

3.2 應(yīng)激處理導(dǎo)入海藻糖對(duì)乳酸菌噴霧干燥抗性的影響

許多研究發(fā)現(xiàn)，將海藻糖導(dǎo)入乳酸菌細(xì)胞內(nèi)，可以顯著提高乳酸菌的噴霧干燥抗性。目前，將海藻糖導(dǎo)入菌體細(xì)胞內(nèi)的常用方法主要為電穿孔法和構(gòu)建工程菌株法。Gong Pimin等的研究表明，采用低電場(chǎng)、多脈沖電穿孔技術(shù)可將海藻糖有效導(dǎo)入乳酸菌細(xì)胞內(nèi)；當(dāng)胞內(nèi)海藻糖積累至一定濃度時(shí)，乳酸菌在噴霧干燥條件下的存活率甚至可達(dá)100%。Li Yan等的研究表明，通過(guò)DNA重組技術(shù)將嗜熱菌的海藻糖合成酶基因與載體pET-22b進(jìn)行重組并導(dǎo)入大腸桿菌，可顯著提高其胞內(nèi)海藻糖的合成能力，同時(shí)提高其耐熱性；但這兩種方法均有明顯局限性，電穿孔法易對(duì)菌株細(xì)胞膜造成嚴(yán)重?fù)p傷，甚至?xí)?dǎo)致菌株死亡，而基因工程的操作復(fù)雜，且可能因遺傳修飾等造成菌株喪失原有的益生特性，失去其應(yīng)用價(jià)值。

在對(duì)酵母菌的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激條件下，海藻糖可以作為菌株的應(yīng)激保護(hù)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)積累，這通常被認(rèn)為是酵母菌通過(guò)自身合成途徑實(shí)現(xiàn)的。由于諸多研究表明乳酸菌不具有相似的自身合成海藻糖的途徑，因此鮮有通過(guò)應(yīng)激處理的方法將海藻糖導(dǎo)入乳酸菌菌體內(nèi)的研究。

為此，本團(tuán)隊(duì)嘗試通過(guò)應(yīng)激處理的方法將海藻糖導(dǎo)入乳酸菌胞內(nèi)，選取了具有高降膽固醇、耐胃酸、耐膽鹽功能的植物乳植桿菌LIP-1展開(kāi)了進(jìn)一步研究，將穩(wěn)定期的植物乳植桿菌LIP-1分別進(jìn)行44 ℃、10 min的熱應(yīng)激處理和10 ℃、1.5 h的冷應(yīng)激處理，并在應(yīng)激液中外源添加4%的海藻糖，發(fā)現(xiàn)菌株胞內(nèi)海藻糖的積累量顯著提升達(dá)到2.62 μg/107 cells，噴霧干燥存活率也從20.99%提高到48.37%，深入探究其內(nèi)在機(jī)制發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量的下降，而外源海藻糖的加入通過(guò)上調(diào)lysR、fab、acc及cfa等關(guān)鍵基因的表達(dá)，顯著提高細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量與飽和脂肪酸含量的比值，優(yōu)化了細(xì)胞膜中脂質(zhì)的組成，增強(qiáng)了其完整性；磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)將外源添加的海藻糖磷酸化為海藻糖-6-磷酸后轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)，在海藻糖-6-磷酸水解酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入糖酵解途徑，過(guò)程中丙酮酸激酶的基因和蛋白表達(dá)上調(diào)，大量生成丙酮酸，丙酮酸可以轉(zhuǎn)化為乳酸，為機(jī)體供能，也可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A被乙酰輔酶A羧化酶催化生成丙二酰輔酶A，參與脂肪酸的合成，對(duì)菌株細(xì)胞膜脂肪酸的組成進(jìn)行調(diào)整，增強(qiáng)細(xì)胞膜的完整性，進(jìn)而提高菌株噴霧干燥下的存活率；與熱應(yīng)激相比，冷應(yīng)激與海藻糖的協(xié)同作用更顯著地增加了菌株胞內(nèi)海藻糖的積累量，菌株胞內(nèi)海藻糖積累量可高達(dá)6.04 μg/107 cells，也更有效地減輕了噴霧干燥對(duì)菌株細(xì)胞膜、細(xì)胞壁及DNA的損傷，將植物乳植桿菌LIP-1的噴霧干燥存活率提高了2.8 倍，更重要的是，這種協(xié)同效應(yīng)還顯著上調(diào)了LuxS和cysE基因的表達(dá)水平，研究表明，LuxS/AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控生物膜形成的過(guò)程，而cysE基因的表達(dá)能夠顯著增加生物膜中多糖類物質(zhì)的合成量，從而促進(jìn)生物膜的積累，為菌株提供更堅(jiān)固的保護(hù)屏障；冷應(yīng)激與海藻糖的協(xié)同作用還激活了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，顯著上調(diào)了糖類轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)了外源海藻糖向胞內(nèi)的高效轉(zhuǎn)運(yùn)，實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)海藻糖的極高積累。劉佳等的研究揭示了應(yīng)激處理不僅可以將外源添加的海藻糖導(dǎo)入乳酸菌胞內(nèi)，也可以刺激乳酸菌使其自身產(chǎn)生海藻糖，并與冷應(yīng)激和熱應(yīng)激協(xié)同作用，更加顯著地提高乳酸菌噴霧干燥的抗性（圖5）。

5

結(jié) 語(yǔ)

乳酸菌菌粉作為一種益生菌補(bǔ)充劑，可以改善人體腸道健康、降低膽固醇、增強(qiáng)人體免疫力等，通過(guò)噴霧干燥制備乳酸菌菌粉是目前常用的一種更具經(jīng)濟(jì)效益的手段，本文總結(jié)了通過(guò)不同應(yīng)激處理及提高胞內(nèi)海藻糖含量提高乳酸菌噴霧干燥抗性的方法。通過(guò)應(yīng)激處理提高乳酸菌胞內(nèi)海藻糖含量的新方法較電穿孔法、構(gòu)建工程菌株法而言，操作更簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞損傷也更小，且應(yīng)激處理提高乳酸菌的耐受性的同時(shí)可與海藻糖協(xié)同作用，更加顯著地提高菌株的噴霧干燥抗性，此外，本團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)應(yīng)激處理不僅可以將外源添加的海藻糖導(dǎo)入乳酸菌胞內(nèi)，還可以刺激乳酸菌使其自身產(chǎn)生海藻糖，故此方法具有很大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

此外，大多研究只關(guān)注提高乳酸菌的抗性，并未探究抗性提高后的菌株功能特性是否發(fā)生改變，在食品、醫(yī)藥等方面是否有更高的應(yīng)用價(jià)值，實(shí)際應(yīng)用成本是否過(guò)高等方面，一種具有價(jià)值的提高乳酸菌抗性的方法，應(yīng)該與商業(yè)化應(yīng)用結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)研究成果向社會(huì)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化。

通信作者：

王俊國(guó)教授

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 副院長(zhǎng)

教育經(jīng)歷：

2004/09-2009/02，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，博士；

2000/09-2003/07，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，碩士；

1991/09-1995/07，天津科技大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，學(xué)士。

工作經(jīng)歷：

1995/07-2000/06，內(nèi)蒙古乳制品研究培訓(xùn)中心益得乳制品實(shí)驗(yàn)廠，副廠長(zhǎng)；

1998/01-1998/05，日本國(guó)北海道酪農(nóng)大學(xué)及明治乳業(yè)中央研究所，短期研修；

2004/08-2010/08，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，助理研究員；

2009/02-2010/02，美國(guó)佛蒙特大學(xué)，訪問(wèn)學(xué)者；

2010/09-2014/08，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，副教授 ；

2014/07-至今，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，教授；

2015/02-2016/01，荷蘭瓦赫寧根大學(xué)，訪問(wèn)學(xué)者。

相關(guān)科研與學(xué)術(shù)經(jīng)歷：

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目，基于熱激-修復(fù)處理結(jié)合外源添加海藻糖提高植物乳植桿菌噴霧干燥抗性和貯藏穩(wěn)定性的內(nèi)在機(jī)制研究，課題負(fù)責(zé)人；

2.自治區(qū)自然科學(xué)基金，熱激-修復(fù)處理提高植物乳植桿菌噴霧干燥存活率及貯藏穩(wěn)定性內(nèi)在機(jī)制的研究，課題負(fù)責(zé)人。

第一作者：

任文榮

教育經(jīng)歷：

2024/08-至今，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程，研究生在讀；

2020/09-2024/06，河北科技大學(xué)，食品科學(xué)與工程，學(xué)士。

研究方向：

利用應(yīng)激處理以及外源添加碳源來(lái)提高乳酸菌在噴霧干燥下的抗性。

獲得榮譽(yù)：

全國(guó)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽內(nèi)蒙古自治區(qū)銅獎(jiǎng)。

引文格式：

任文榮, 王俊國(guó). 應(yīng)激處理及外源添加海藻糖對(duì)乳酸菌噴霧干燥抗性影響的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2025, 46(24): 335-342. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250625-178.

REN Wenrong, WANG Junguo. Research progress on the effects of stress treatment and exogenous addition of trehalose on the spray drying resistance of lactic acid bacteria[J]. Food Science, 2025, 46(24): 335-342. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250625-178.

實(shí)習(xí)編輯：李雄；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來(lái)源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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