抗溶脹可生物降解水凝膠重塑電微環(huán)境，驅(qū)動(dòng)腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)再生

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）后產(chǎn)生的實(shí)質(zhì)性腦組織缺損，是神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)。暴力外部機(jī)械沖擊直接破壞腦組織并損害神經(jīng)功能，常導(dǎo)致局灶性組織缺失和壞死空洞形成。然而，成人大腦有限的再生能力和不充分的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制嚴(yán)重限制了治療效果。更關(guān)鍵的是，TBI部位惡劣的損傷微環(huán)境導(dǎo)致內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞招募不足和膠質(zhì)細(xì)胞異常激活。盡管外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植被認(rèn)為是一種有前景的策略，但細(xì)胞來(lái)源有限、存活率低、分化效率不佳以及免疫排斥等問(wèn)題阻礙了其臨床轉(zhuǎn)化，且該方法無(wú)法為功能性神經(jīng)回路重建提供結(jié)構(gòu)支撐。因此，開(kāi)發(fā)一種兼具抗溶脹性能和微環(huán)境重塑能力的活性生物材料基質(zhì)，成為了該領(lǐng)域的研究前沿。

針對(duì)上述挑戰(zhàn)，天津大學(xué)崔春燕副研究員、劉文廣教授、清華大學(xué)李舟教授團(tuán)隊(duì)，設(shè)計(jì)了一種通過(guò)兩種美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的藥物——硫辛酸和二甲雙胍——經(jīng)多氫鍵作用超分子自組裝而成的抗溶脹、可生物降解的粘附性水凝膠。該水凝膠基質(zhì)能夠模擬天然腦組織的力學(xué)和電學(xué)特性。在降解過(guò)程中，釋放的硫辛酸可將損傷部位重塑為促再生微環(huán)境，而二甲雙胍則能促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞自發(fā)募集至缺損區(qū)域。當(dāng)與柔性皮層電極和外源性電刺激整合時(shí)，該系統(tǒng)能進(jìn)一步引導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為功能性神經(jīng)元。在大量腦缺損大鼠模型中，該策略實(shí)現(xiàn)了14.8倍的神經(jīng)干細(xì)胞招募增加和11.3倍的神經(jīng)元分化增強(qiáng)，并使組織缺損體積減少78%，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了顯著的功能恢復(fù)。相關(guān)論文以“An antiswelling biodegradable hydrogel reshapes electro-microenvironment to drive endogenous neuroregeneration after brain defect”為題，發(fā)表在Science Advances上。

圖1. LMSA水凝膠的設(shè)計(jì)及其與電刺激策略結(jié)合的示意圖。 展示了LMSA水凝膠的構(gòu)建及其與ECoG電極整合用于TBI后電刺激和信號(hào)監(jiān)測(cè)的示意圖。該系統(tǒng)協(xié)同招募并誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，同時(shí)抑制神經(jīng)炎癥并促進(jìn)血管生成，從而實(shí)現(xiàn)多功能腦修復(fù)。

研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)水凝膠的制備和特性進(jìn)行了系統(tǒng)表征。他們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)精確調(diào)控硫辛酸與二甲雙胍的比例，可將硫辛酸的去質(zhì)子化程度控制在95.72%至97.2%之間，此時(shí)系統(tǒng)能夠自發(fā)自組裝形成水凝膠（圖2，A和B）。傅里葉變換紅外光譜證實(shí)了強(qiáng)離子氫鍵和鹽橋氫鍵的形成（圖2C）。等溫滴定量熱法分析表明，硫辛酸與二甲雙胍之間的相互作用是焓驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過(guò)程，解離常數(shù)為3.23×10?? M，證實(shí)了特異性氫鍵結(jié)合的存在（圖2D）。拉曼光譜中二硫鍵特征峰的分裂表明硫辛酸二硫五元環(huán)發(fā)生了開(kāi)環(huán)聚合（圖2E）。X射線衍射圖譜顯示，與純硫辛酸和二甲雙胍的尖銳結(jié)晶峰不同，該水凝膠呈現(xiàn)出寬泛的無(wú)定形圖案，進(jìn)一步確認(rèn)了開(kāi)環(huán)聚合的發(fā)生（圖2F）。

圖2. LMSA水凝膠的表征。 (A) 顯示不同組成比例的LA和Met溶液凝膠化能力的數(shù)碼照片。(B) 不同濃度LA和Met的相圖。(C) 不同組成的LA、Met和LMSA水凝膠的FTIR光譜。(D) Met滴定LA的ITC原始數(shù)據(jù)、擬合曲線及熱力學(xué)參數(shù)。(E) 不同組成的LA、Met和LMSA水凝膠的拉曼光譜。(F) 不同組成的LA、Met和LMSA水凝膠的XRD圖譜。

在力學(xué)性能方面，時(shí)間掃描結(jié)果顯示儲(chǔ)能模量始終大于損耗模量，證實(shí)了水凝膠的穩(wěn)固凝膠狀態(tài)（圖3A）。角頻率掃描測(cè)試表明，在接近人體固有節(jié)律的100 rad/s頻率下，水凝膠的儲(chǔ)能模量落在天然腦組織0.2至3.1 kPa的范圍內(nèi)，這種組織匹配的模量對(duì)于最大程度減少對(duì)周?chē)h(huán)境的機(jī)械損傷至關(guān)重要（圖3B）。剪切速率-粘度曲線顯示了典型的剪切變稀行為，使其能夠輕松通過(guò)注射器擠出并填充不規(guī)則形狀的缺損（圖3C）。在組織粘附性能評(píng)估中，該水凝膠對(duì)包括腦組織在內(nèi)的多種濕軟組織表現(xiàn)出強(qiáng)粘附性，在180度傾斜的表面上新鮮大鼠腦組織仍能穩(wěn)定粘附而不脫落（圖3，D和E）。定量測(cè)試顯示，探針 tack測(cè)試的脫附力隨硫辛酸/二甲雙胍含量增加而顯著增加（圖3，F(xiàn)和G）。搭接剪切測(cè)試顯示，LMSA-0.3在新鮮豬皮膚上表現(xiàn)出最高的粘附強(qiáng)度，為16.21±0.55 kPa（圖3，H和I）。180°剝離測(cè)試中，LMSA-0.3的界面韌性最強(qiáng)，達(dá)到133.42±13.53 J/m2（圖3，J和K）。對(duì)豬坐骨神經(jīng)的拉伸測(cè)試顯示，粘附力最高可達(dá)15.90 cN，這對(duì)于緩解神經(jīng)修復(fù)過(guò)程中的神經(jīng)外膜彈性回縮至關(guān)重要（圖3，L和M）。

圖3. LMSA水凝膠的力學(xué)和粘附性能。 (A) 不同組成LMSA水凝膠的時(shí)間掃描。(B) 不同組成LMSA水凝膠的角頻率掃描。(C) 不同組成LMSA水凝膠的剪切速率-粘度曲線。(D) LMSA-0.25對(duì)各種濕組織的粘附能力。(E) 使用傾斜平面法評(píng)估LMSA水凝膠粘附效果。(F和G) 不同組成LMSA水凝膠的探針 tack測(cè)試曲線和最大粘附力。(H和I) 不同組成LMSA水凝膠在新鮮豬皮膚上的搭接剪切測(cè)試曲線和粘附強(qiáng)度。(J和K) 不同組成LMSA水凝膠在新鮮豬皮膚上的180°剝離測(cè)試曲線和界面韌性。(L和M) 不同組成LMSA水凝膠在新鮮豬坐骨神經(jīng)上的拉伸測(cè)試曲線和拉伸力。

在導(dǎo)電性能方面，該水凝膠通過(guò)羧基的氫離子作為主要電荷載流子實(shí)現(xiàn)離子導(dǎo)電（圖4A）。導(dǎo)電率范圍為0.3至0.7 S/m，與生理神經(jīng)組織相匹配（圖4B）。與先前報(bào)道的用于TBI治療的水凝膠相比，LMSA-0.25展現(xiàn)出與神經(jīng)組織相匹配的力學(xué)強(qiáng)度和電導(dǎo)率，以及輔助粘附效應(yīng)（圖4C）。將水凝膠與柔性電極整合后，電極在低頻至生理相關(guān)頻率范圍內(nèi)阻抗顯著低于金電極（圖4，D和E）。循環(huán)伏安掃描顯示水凝膠整合電極的電荷存儲(chǔ)容量大于金電極（圖4，F(xiàn)和G）。在1000次循環(huán)伏安掃描后，水凝膠整合電極的阻抗變化可忽略不計(jì)，表現(xiàn)出優(yōu)異的循環(huán)穩(wěn)定性（圖4H）。在±0.1 V、1 ms的固定電壓脈沖刺激下，水凝膠整合電極實(shí)現(xiàn)了比金電極更高的電流密度（圖4I），并在長(zhǎng)期循環(huán)測(cè)試中保持穩(wěn)定的電荷注入性能（圖4J）。

圖4. LMSA水凝膠的導(dǎo)電性能。 (A) LMSA水凝膠離子傳導(dǎo)機(jī)制示意圖。(B) 不同組成LMSA水凝膠的電導(dǎo)率。(C) 將LMSA水凝膠的模量、電導(dǎo)率和粘附強(qiáng)度與先前報(bào)道的用于TBI治療的水凝膠進(jìn)行比較。(D) Au電極和水凝膠電極在全頻率范圍內(nèi)的阻抗譜。(E) 1 kHz下的阻抗幅值比較。(F) -0.5至0.1 V的CV掃描。(G) CSC定量。(H) 1000次CV循環(huán)后的循環(huán)后阻抗譜。(I) +0.1 V脈沖刺激下的電荷密度瞬態(tài)。(J) 循環(huán)測(cè)試期間的電荷注入容量保持率。

在細(xì)胞相容性評(píng)估中，活-死染色和CCK-8檢測(cè)顯示，即使在1 mg/ml濃度下，LMSA-0.25水凝膠對(duì)PC12細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞均無(wú)顯著細(xì)胞毒性（圖5，A至C）。示意圖展示了電刺激與水凝膠聯(lián)合干預(yù)顯著促進(jìn)神經(jīng)元分化的機(jī)制（圖5D）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在8小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，水凝膠聯(lián)合電刺激組的細(xì)胞遷移面積達(dá)到46.66±4.53%，顯著高于對(duì)照組的22.45±5.17%（圖5，E和F）。免疫熒光染色顯示，電刺激顯著增強(qiáng)了神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，分化率達(dá)到約60%，而水凝膠聯(lián)合電刺激則將分化率進(jìn)一步提升至近80%（圖5，G和H）。

圖5. LMSA水凝膠+電刺激的細(xì)胞相容性及對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的促進(jìn)活性。 (A) 活-死染色表征LMSA-0.25水凝膠對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞相容性。(B) 檢測(cè)PC12細(xì)胞與LMSA-0.25水凝膠共培養(yǎng)細(xì)胞活力的CCK-8檢測(cè)。(C) 檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞與LMSA-0.25水凝膠共培養(yǎng)細(xì)胞活力的CCK-8檢測(cè)。(D) 示意圖顯示電刺激與水凝膠聯(lián)合干預(yù)顯著促進(jìn)神經(jīng)元分化。(E) 8小時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(F) 劃痕實(shí)驗(yàn)中傷口愈合百分比的定量分析。(G) 神經(jīng)干細(xì)胞的Nestin和Tuj-1免疫熒光圖像。Nestin標(biāo)記為紅色，Tuj-1標(biāo)記為綠色。細(xì)胞核用藍(lán)色DAPI標(biāo)記。(H) 基于免疫熒光染色結(jié)果的Tuj-1陽(yáng)性表達(dá)比例。(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明，水凝膠降解產(chǎn)物能顯著促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的趨化遷移。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)采用控制性皮層撞擊法建立了大鼠大量腦缺損模型（圖6，A和B）。電刺激通過(guò)植入的柔性電極每天連續(xù)五天、每次20分鐘的方式遞送（圖6，C和D），示波器記錄的代表性雙相電流刺激波形如圖6E所示。免疫熒光染色結(jié)果顯示，在傷后第7天，水凝膠聯(lián)合電刺激組的巢蛋白陽(yáng)性面積達(dá)到25.2±2.25%，較未治療TBI組的1.7±0.08%實(shí)現(xiàn)了14.8倍的增加，證實(shí)了該策略對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的有效招募（圖6，F(xiàn)和H）。在傷后第14天，聯(lián)合治療組的Tuj-1陽(yáng)性表達(dá)增加了11.3倍（圖6，G和I）。京都基因與基因組百科全書(shū)通路富集分析表明，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路中（圖6J）。磷酸化ERK1/2的表達(dá)在聯(lián)合治療組中顯著升高（圖6，K和M），基因集富集分析進(jìn)一步證實(shí)了相關(guān)通路的富集（圖6L）。

圖6. LMSA水凝膠+電刺激促進(jìn)損傷部位內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的招募和分化。 (A) 照片顯示建立大鼠TBI模型以及水凝膠注射和電極植入的手術(shù)過(guò)程示意圖。(B) 植入電極的數(shù)碼照片。(C) 大鼠在記錄電信號(hào)過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)圖像。(D) 一次典型的電刺激療程持續(xù)20分鐘。(E) 示波器記錄的電刺激波形。(F) 傷后7天損傷區(qū)域Nestin（綠色）的典型免疫熒光染色圖片，用于研究?jī)?nèi)源性NSC的招募。(G) 傷后14天病變區(qū)域Tuj-1（綠色）的典型免疫熒光染色圖片，用于評(píng)估NSC向神經(jīng)元的分化。(H) 每個(gè)視野Nestin陽(yáng)性面積的定量。(I) 每個(gè)視野Tuj-1陽(yáng)性面積的定量。(J) TBI組與TBI+水凝膠+電刺激組之間差異表達(dá)基因的KEGG通路富集氣泡圖。(K) 傷后7天病變區(qū)域p-ERK1/2（紅色）的典型免疫熒光染色圖片。(L) TBI組和TBI+水凝膠+電刺激組的GSEA結(jié)果。(M) 每個(gè)視野p-ERK1/2陽(yáng)性面積的定量。黃色方框表示放大區(qū)域。

在組織修復(fù)評(píng)估中，雙重免疫熒光染色顯示聯(lián)合治療組在傷后第7天顯著抑制了Iba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞和GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活（圖7，A、C和D）。雙重免疫熒光染色顯示聯(lián)合治療組在傷后第28天呈現(xiàn)出最豐富的神經(jīng)絲和髓鞘堿性蛋白陽(yáng)性結(jié)構(gòu)（圖7，B、H和I）。大體標(biāo)本照片顯示，聯(lián)合治療組的組織缺損最小（圖7E）。尼氏染色進(jìn)一步證實(shí)聯(lián)合治療組在傷后第28天顯示出更高的神經(jīng)元密度和活性（圖7F）。Masson三色染色顯示，聯(lián)合治療組的膠原面積比例降至29.65±2.20%，較TBI組的58.50±3.23%減少了近兩倍（圖7G）。組織缺損率的定量分析顯示，聯(lián)合治療組較未治療TBI組減少了78.24%（圖7J）。雷達(dá)圖將LMSA水凝膠聯(lián)合電刺激的性能和修復(fù)效果與最近報(bào)道的TBI治療方法進(jìn)行了全面比較（圖7K）。

圖7. LMSA水凝膠+電刺激重塑微環(huán)境并促進(jìn)腦組織結(jié)構(gòu)重塑。 (A) 傷后7天病變部位Iba-1（紅色）和GFAP（綠色）的代表性雙重免疫熒光染色圖片，用于研究神經(jīng)炎癥的抑制。(B) 傷后28天病變部位NF（紅色）和MBP（綠色）的代表性雙重免疫熒光染色圖片，用于評(píng)估軸突再生和髓鞘再生。(C和D) 每個(gè)視野Iba-1和GFAP陽(yáng)性面積的定量。(E) 傷后28天大鼠腦組織的數(shù)碼照片。紅色虛線表示組織缺失的邊界。(F) 傷后28天所有組別的代表性尼氏染色圖像。紅色虛線表示組織缺失的邊界。(G) 每個(gè)視野膠原面積的定量。(H和I) 每個(gè)視野NF和MBP陽(yáng)性面積的定量。(J) 傷后28天組織缺損率的定量。(K) 將LMSA水凝膠+電刺激的性能和修復(fù)效果與最近報(bào)道的TBI治療方法進(jìn)行比較的雷達(dá)圖。黃色方框表示放大區(qū)域。

在電生理信號(hào)記錄方面，皮層電圖分析顯示，傷后第1天，電刺激組和聯(lián)合治療組均表現(xiàn)出交替的癲癇樣放電和擴(kuò)散性去極化事件（圖8，A和B）。時(shí)間-頻率分析顯示，聯(lián)合治療組在所有評(píng)估時(shí)間點(diǎn)的δ+θ/α+β功率比值均持續(xù)低于電刺激組，表明該聯(lián)合療法有效保護(hù)了丘腦皮質(zhì)功能并減輕了繼發(fā)性損傷的進(jìn)展（圖8C）。

在神經(jīng)功能恢復(fù)評(píng)估中，改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯示聯(lián)合治療組在所有時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分降低最為顯著（圖8D）。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)證實(shí)聯(lián)合治療組在棒上停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)（圖8，E和H）。蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)顯示聯(lián)合治療組的蔗糖偏好指數(shù)改善最為明顯，表明其在緩解抑郁樣行為方面的優(yōu)勢(shì)（圖8，F(xiàn)和I）。莫里斯水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，在21至27天的訓(xùn)練期間，聯(lián)合治療組的逃避潛伏期最短（圖8，J和K），在空間探索實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合治療組在目標(biāo)象限停留時(shí)間最長(zhǎng)且穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)最多（圖8，L和M），表現(xiàn)出顯著更優(yōu)的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

圖8. TBI后ECoG分析和神經(jīng)功能恢復(fù)。 (A) 所示TBI后時(shí)間點(diǎn)的代表性3分鐘ECoG軌跡。ED和SD分別用藍(lán)色和紅色突出顯示。通過(guò)小波變換分析得出的ECoG信號(hào)的時(shí)頻表示。(B) ECoG信號(hào)的時(shí)頻表示。(C) δ+θ/α+β功率比值的時(shí)間演變。(D) mNSS評(píng)分用于檢查大鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。(E和H) 用于評(píng)估大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和平衡能力的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。(F和I) 用于評(píng)估大鼠情緒行為的蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)。(G和J至M) 學(xué)習(xí)和空間記憶階段大鼠的代表性游泳路徑(J)、逃避潛伏期(K)、目標(biāo)區(qū)域時(shí)間比(L)以及通過(guò)Morris水迷宮測(cè)量的平臺(tái)穿越次數(shù)(M)。

總結(jié)而言，該研究開(kāi)發(fā)了一種基于臨床批準(zhǔn)的硫辛酸和二甲雙胍的可注射、導(dǎo)電、粘附性水凝膠，與柔性皮層電極整合后用于創(chuàng)傷性腦損傷治療。該水凝膠實(shí)現(xiàn)了從被動(dòng)結(jié)構(gòu)支撐到主動(dòng)適應(yīng)性神經(jīng)微環(huán)境重編程的范式轉(zhuǎn)變。二甲雙胍促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞招募，硫辛酸重塑不利微環(huán)境以支持神經(jīng)元分化，而外源性電刺激則進(jìn)一步增強(qiáng)了神經(jīng)發(fā)生和功能修復(fù)。該整合平臺(tái)還能實(shí)時(shí)傳輸和記錄局部電生理信號(hào)，為創(chuàng)傷性腦損傷修復(fù)過(guò)程中的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和功能恢復(fù)評(píng)估提供了可能。該策略克服了外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植的關(guān)鍵局限性，為創(chuàng)傷性腦損傷的臨床干預(yù)提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，并為開(kāi)發(fā)反饋控制的神經(jīng)調(diào)控系統(tǒng)奠定了重要基礎(chǔ)。未來(lái)研究將聚焦于建立皮層電圖信號(hào)特征與神經(jīng)功能狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)模型，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)化的反饋控制算法，實(shí)現(xiàn)對(duì)電刺激參數(shù)的動(dòng)態(tài)調(diào)整，推動(dòng)反饋控制神經(jīng)調(diào)控方案的系統(tǒng)化和實(shí)際應(yīng)用。