2025年2月26日，中國科學院上海藥物研究所謝岑、劉雅萌、柳紅團隊，聯(lián)合上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院謝青團隊，并與上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院、臨港實驗室、上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院、上?？萍即髮W、南京中醫(yī)藥大學、美國國家癌癥研究所等單位合作，在Cell Metabolism（中科院1區(qū)，2024 Impact Factor=30.9）在線發(fā)表題為“Hepatic sphingomyelin phosphodiesterase 3 promotes steatohepatitis by disrupting membrane sphingolipid metabolism”的研究論文。該文于2024年7月15日投稿，2024年12月16日修回，2025年1月17日接收，2025年2月26日在線發(fā)表，并發(fā)表于2025年5月6日刊期。

代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）是代謝功能障礙相關脂肪性肝?。∕ASLD）進展中的關鍵階段，其特征包括肝細胞脂肪變性、氣球樣變、炎癥和纖維化。目前，如何從單純脂肪變性進展到MASH，尤其是哪些脂毒性分子真正驅動炎癥和纖維化，仍是該領域的重要科學問題。

該研究聚焦肝臟膜鞘脂代謝，發(fā)現(xiàn)鞘磷脂磷酸二酯酶3（SMPD3）介導的細胞膜鞘磷脂水解，是MASH階段神經酰胺積累的重要來源。研究顯示，肝細胞特異性敲除Smpd3或藥理學抑制SMPD3均可緩解MASH，而重新表達SMPD3則會逆轉保護作用，提示SMPD3并非單純的伴隨性改變，而是推動疾病進展的關鍵節(jié)點。

機制上，脂毒性可誘導DNA損傷，激活PARP并消耗NAD+，繼而抑制沉默信息調節(jié)因子1（SIRT1）活性，最終導致SMPD3轉錄上調。升高的SMPD3破壞質膜上鞘磷脂-神經酰胺平衡，一方面增強小窩依賴性脂質攝取，促進肝細胞脂質積累；另一方面促進脂肪變性肝細胞釋放攜帶促炎、促纖維化信號的胞外囊泡，加重巨噬細胞炎癥極化和肝星狀細胞活化。

更值得關注的是，研究者進一步發(fā)現(xiàn)雙功能分子DC17，可同時激活SIRT1并抑制SMPD3。在飲食誘導的MASH模型中，DC17較單一SIRT1激活劑或SMPD3抑制劑顯示出更優(yōu)的干預效果。該研究不僅提出了“脂毒性-DNA損傷-PARP-SIRT1-SMPD3”這一新的MASH病理軸，也提示靶向肝臟SMPD3、恢復膜鞘脂代謝穩(wěn)態(tài)，可能成為進展期MASH治療的新方向。

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【摘要】

代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）仍然是重要的健康挑戰(zhàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，鞘磷脂磷酸二酯酶3（SMPD3）可通過增強細胞膜上的鞘磷脂水解，促進肝臟神經酰胺積累，是推動MASH進展的關鍵因素。

在肝細胞中特異性破壞 Smpd3 基因，或通過藥物抑制 SMPD3，均可緩解MASH；而重新引入 SMPD3 則會逆轉這種改善作用。健康肝臟中 SMPD3 表達水平較低，但在MASH過程中，脂毒性誘導的DNA損傷會抑制沉默信息調節(jié)因子1（SIRT1），進而觸發(fā) SMPD3 上調。SMPD3升高會破壞膜上鞘磷脂與神經酰胺之間的平衡，并通過增強小窩依賴性脂質攝取，以及促進脂肪變性肝細胞釋放胞外囊泡，加重炎癥和纖維化，從而推動疾病進展。

因此，SMPD3可作為整合MASH多個關鍵病理特征的中心節(jié)點。值得注意的是，研究者還發(fā)現(xiàn)了一種雙功能小分子，可同時激活SIRT1并抑制SMPD3，在MASH治療中顯示出較好的潛在應用價值。上述發(fā)現(xiàn)提示，抑制肝臟SMPD3有助于恢復膜鞘脂代謝平衡，并為開發(fā)新的MASH治療策略提供了重要依據。

01

研究背景及科學問題

代謝功能障礙相關脂肪性肝?。∕ASLD），既往被稱為非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD），是導致肝硬化、肝癌和肝移植的重要原因之一，影響全球約四分之一成年人。代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）的典型病理特征包括脂肪變性、肝細胞氣球樣變、炎癥和纖維化。MASH是疾病進入需要積極干預階段的重要節(jié)點，但目前有效治療手段仍然有限。

從單純脂肪變性進展為MASH的關鍵驅動因素之一是脂毒性。脂毒性可引發(fā)細胞應激、肝損傷、炎癥反應和纖維生成。然而，究竟哪些脂毒性分子在其中發(fā)揮核心作用，以及這些分子如何觸發(fā)下游病理事件，目前仍未完全明確。

鞘脂在細胞膜結構和細胞功能調控中具有多重作用。肝臟是鞘脂合成的重要部位，因此也更容易受到脂毒性鞘脂的影響。鞘脂代謝失衡與MASLD發(fā)生發(fā)展密切相關，其中神經酰胺被認為是脂毒性的重要參與者。神經酰胺處于鞘脂代謝網絡的核心，主要通過兩條途徑產生：一是從頭合成，涉及SPTLCs、CERSs和DEGSs等酶；二是鞘磷脂水解。關于從頭合成途徑在肥胖、糖尿病和MASLD中的作用，已有較多研究。神經酰胺形成后還能進一步轉化為鞘磷脂，因此理論上MASLD中鞘磷脂也應明顯增加。值得注意的是，MASLD患者常表現(xiàn)為神經酰胺水平升高，而鞘磷脂變化相對較小，這提示鞘磷脂水解可能在MASLD進展中具有重要但尚未充分研究的作用。

鞘磷脂磷酸二酯酶（SMPDs）可在多種刺激下，切除膜結合鞘磷脂中的磷酸膽堿基團，快速生成神經酰胺。根據最適pH以及在不同細胞器、細胞和組織中的分布，SMPDs可分為酸性、中性和堿性家族。對多個MASLD數(shù)據集的分析顯示，SMPD3，也稱中性鞘磷脂酶2（nSMase2），在MASLD肝臟中顯著升高。SMPD3主要定位于質膜（PM）內側小葉和高爾基體，并參與細胞凋亡、應激反應、炎癥信號轉導以及胞外囊泡（EV）介導的細胞間通訊。由于這些過程與MASLD尤其是MASH的發(fā)生機制密切相關，本研究進一步探討了SMPD3及鞘磷脂水解途徑在MASLD/MASH進展中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，MASH患者血清神經酰胺升高主要來源于SMPD3介導的鞘磷脂水解，而非從頭合成途徑。盡管健康人肝臟中SMPD3表達很低，但在脂肪變性向MASH進展過程中，脂毒性可觸發(fā)SIRT1依賴的SMPD3上調，尤其是在質膜部位。這一變化進一步增強小窩依賴性脂質攝取，并促進促炎、促纖維化胞外囊泡釋放。肝臟Smpd3基因破壞或SMPD3抑制可顯著改善MASH。研究者還發(fā)現(xiàn)了DC17這一可同時激活SIRT1并抑制SMPD3的雙功能分子，其在MASH模型中顯示出明顯治療潛力?？傮w而言，本研究揭示了質膜鞘磷脂-神經酰胺失衡是MASH的特征性代謝改變，并提示SMPD3可能成為有前景的治療靶點。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

MASH階段肝臟鞘磷脂水解與SMPD3表達升高

研究者首先分析了87名受試者的鞘脂譜，包括健康對照者、經肝活檢確認的代謝功能障礙相關單純脂肪變性（MASL）患者和MASH患者。結果顯示，血清神經酰胺和二氫神經酰胺在MASL和MASH階段均明顯升高，其中神經酰胺在MASH階段進一步增加。鞘磷脂也有升高，但其積累程度不及神經酰胺。

為了判斷神經酰胺積累主要來自從頭合成還是鞘磷脂水解，研究者進一步檢測了神經酰胺/二氫神經酰胺（Cer/DhCer）比值和神經酰胺/鞘磷脂（Cer/SM）比值。結果顯示，Cer/SM比值隨血清神經酰胺水平升高而顯著增加，尤其在MASH階段更明顯；相反，Cer/DhCer比值下降。進一步分析發(fā)現(xiàn)，神經酰胺和Cer/SM比值與疾病嚴重程度指標呈正相關，包括NAFLD活動評分（NAS）、血清甘油三酯（TG）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、胰島素和穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。而鞘磷脂本身以及Cer/DhCer比值并未顯示出同樣的相關性。

在另一個包含168名受試者的驗證隊列中，研究者也觀察到血清神經酰胺和Cer/SM比值在MASLD中升高，并與血清TG、ALT和AST呈正相關。這些結果提示，在MASLD進展過程中，鞘磷脂水解增強可能是導致神經酰胺積累的重要代謝改變。

為了尋找驅動這一變化的具體酶，研究者分析了多個人類MASLD數(shù)據集中鞘脂代謝酶的mRNA表達譜。雖然編碼鞘磷脂酶的多個基因在MASH進展中有所上調，但SMPD3在MASLD不同階段均呈持續(xù)升高，并與疾病嚴重程度呈正相關。相比之下，參與神經酰胺從頭合成的酶并未表現(xiàn)出一致變化。MASLD患者肝組織切片進一步證實，健康肝臟中SMPD3蛋白表達較低，而從健康對照到MASH階段，SMPD3表達逐漸升高。

在膽堿缺乏高脂飲食（CD-HFD）誘導的MASH小鼠肝臟中，研究者也觀察到類似趨勢：Cer/SM比值升高比Cer/DhCer比值變化更明顯，同時SMPD3表達上調，而SPTLC2未發(fā)生明顯變化。在Gubra-amylin MASH飲食（GAN）模型和高脂蛋氨酸/膽堿缺乏飲食（HFMCD）模型中，結果同樣一致。MASH階段的Cer/SM比值高于MASL階段，且SMPD3上調與MASLD進展同步。值得注意的是，與胞質組分相比，質膜組分中SMPD3表達增強更明顯，Cer/SM比值升高也更突出，進一步支持MASH過程中肝臟特定膜結構發(fā)生鞘磷脂-神經酰胺失衡。

總體來看，雖然神經酰胺從頭合成途徑在MASLD不同階段均有活性，但本研究揭示出一個更具有MASH階段特征的代謝信號：SMPD3介導的鞘磷脂水解明顯增強，尤其發(fā)生在質膜結構中，并將MASLD進展與鞘脂代謝紊亂聯(lián)系起來。

圖1：MASH階段肝臟中SMPD3介導的鞘磷脂-神經酰胺代謝被激活。（A）臨床隊列1的分組。（B）血清鞘脂熱圖。（C）血清Cer/DhCer和Cer/SM比值。（D）Cer/DhCer和Cer/SM比值與臨床指標之間的相關性。（E）臨床隊列2的分組、血清神經酰胺、Cer/SM比值，以及神經酰胺與臨床指標之間的相關性。（F）GEO數(shù)據集中SMPD3表達與臨床指標之間的相關性。（G）肝活檢樣本中SMPD3代表性染色及定量分析；比例尺，50 μm。（H）MASLD小鼠模型示意圖。（I）肝臟SMPD3表達的免疫印跡結果，n = 3/組。（J和K）肝臟樣本膜組分（J）和胞質組分（K）中SMPD3免疫印跡，以及神經酰胺、SM和Cer/SM比值豐度分析，n = 5–10/組。數(shù)據以均值 ± SEM表示。兩組之間采用非配對Student’s t檢驗；多組之間采用單因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S1。

肝細胞SMPD3缺失緩解MASH，而重新表達SMPD3會逆轉保護作用

考慮到肝臟微環(huán)境由肝細胞和非實質細胞（NPCs）共同組成，研究者利用MASLD患者單核測序數(shù)據分析SMPD3表達來源。結果顯示，SMPD3主要表達于肝細胞和膽管細胞。由于肝細胞在肝臟中占比高，可能對肝臟總體SMPD3表達水平貢獻更大。值得注意的是，隨著MASLD進展，肝細胞中SMPD3表達逐步升高，而膽管細胞中的表達相對穩(wěn)定。

基于這一結果，研究者構建了肝細胞特異性SMPD3敲除小鼠（HKO）。與對照Smpd3fl/fl（FLOX）小鼠相比，HKO小鼠肝臟和血清中的神經酰胺水平及Cer/SM比值明顯下降。在低脂飲食（LFD）條件下，由于SMPD3本身在肝臟中表達較低，SMPD3缺失并未影響小鼠基礎代謝特征和肝功能，表現(xiàn)為不同基因型小鼠肝重、ALT、AST、肝臟TG、總膽固醇（TC）和羥脯氨酸（HYP，纖維化標志物）水平相近。

然而，當小鼠接受可誘導MASH的GAN飲食后，HKO小鼠較FLOX對照小鼠表現(xiàn)出明顯更輕的疾病表型，提示其對MASH發(fā)生具有抵抗作用。盡管低脂飲食下HKO小鼠非酯化脂肪酸（NEFA）水平高于FLOX小鼠，但這些水平仍遠低于GAN飲食小鼠；在GAN飲食條件下，不同基因型之間NEFA無明顯差異?？紤]到衰老會增加人群MASH風險，研究者還讓老年小鼠接受GAN飲食，以模擬人類疾病進展。結果顯示，老年HKO小鼠同樣表現(xiàn)出較輕的MASH癥狀，并且肝臟中細胞衰老標志物p16和p21表達較低。HFMCD飲食模型中也觀察到類似保護作用，提示SMPD3在MASH中的作用并不局限于肥胖相關背景。

進一步地，研究者通過AAV-Smpd3注射建立肝細胞特異性Smpd3過表達模型。出乎意料的是，盡管強制過表達SMPD3可增加肝臟神經酰胺和Cer/SM比值，但并未顯著加重MASH病理。這可能提示在特定質膜區(qū)域存在“飽和效應”，即SMPD3結合位點有限。為了支持這一可能性，研究者在HKO小鼠中重新引入SMPD3，結果發(fā)現(xiàn)其完全逆轉了SMPD3缺失帶來的保護作用，使MASH嚴重程度接近FLOX小鼠。即便重新引入SMPD3組的神經酰胺和Cer/SM比值高于FLOX組，其疾病嚴重程度仍與FLOX相當。為了判斷SMPD3的水解活性是否必要，研究者又在HKO小鼠中重新引入失活型SMPD3突變體（D428A,K433A）。與野生型SMPD3不同，該突變體明顯削弱了逆轉保護作用的能力。

這些結果說明，肝細胞特異性SMPD3缺失可在多個小鼠模型中改善MASH；而重新表達SMPD3則通過質膜鞘磷脂水解加重疾病進展。

為了將小鼠結果與人類MASH聯(lián)系起來，研究者比較了小鼠模型中的基因表達模式與人類MASLD嚴重程度特征基因。該特征基因可反映從健康狀態(tài)、相對良性階段（MASL和F0-F1）到纖維化/肝硬化階段（F2-F4）的疾病進展。層次聚類顯示，GAN飲食和HFMCD飲食下的FLOX小鼠均與人類纖維化樣本（F2-F3）聚類，而GAN飲食下HKO小鼠更接近較輕的人類疾病階段（MASL/F0-F1），HFMCD飲食下HKO小鼠則接近F2階段。這提示SMPD3缺失可使疾病表達譜向較早階段轉變。

圖2：肝臟SMPD3缺失可保護小鼠免于MASH進展，而在敲除小鼠中重新表達SMPD3會加重疾病。（A）實驗示意圖，n = 5–7/組。（B）肝臟重量。（C）血清ALT、AST、TG和NEFA。（D）肝臟TG、NEFA、TC和HYP。（E）肝組織切片代表性H&E、油紅O和天狼星紅染色，以及NAS評分；比例尺，100 μm。（F）實驗示意圖，n = 5–8/組。（G）肝臟Cer/SM比值。（H）肝臟重量。（I）血清ALT、AST、TG和NEFA。（J）肝臟TG、NEFA、TC和HYP。（K）肝組織切片代表性H&E組織學、油紅O和天狼星紅染色，以及NAS評分；比例尺，100 μm。（L）實驗示意圖，n = 5–8/組。（M）肝臟Cer/SM比值。（N）血清ALT、AST和TG。（O）肝臟TG、TC和HYP。（P）肝組織切片代表性H&E組織學、油紅O和天狼星紅染色，以及NAS評分；比例尺，100 μm。數(shù)據以均值 ± SEM表示。兩組之間采用非配對Student’s t檢驗；多組之間采用單因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S2和圖S3。

SMPD3缺失限制MASH發(fā)展過程中的肝細胞脂質攝取

為了進一步解釋肝細胞特異性SMPD3敲除如何改善MASH，研究者對GAN和HFMCD兩種模型的肝臟RNA測序數(shù)據進行了通路富集分析?；虮倔w（GO）分析顯示，SMPD3缺失小鼠肝臟中的脂質和固醇代謝過程增強，而炎癥和纖維化相關通路下降。基因集富集分析（GSEA）進一步證實，與FLOX對照相比，HKO小鼠的脂質儲存、炎癥和細胞外基質組織相關通路降低。

隨后，研究者檢測SMPD3如何影響細胞內脂質含量。結果顯示，在基礎條件下，SMPD3敲低或缺失影響較?。坏谥舅岽碳は?，SMPD3缺失可顯著減少脂質積累，而SMPD3過表達則產生相反效果。值得注意的是，在GAN和HFMCD誘導模型中，SMPD3缺失后肝臟從頭脂肪生成（DNL）通路并未發(fā)生明顯改變。這與既往觀察一致，即MASLD中肝臟TG僅約26%來源于DNL，大部分來自脂肪動員和飲食來源。

為探索其他途徑，研究者進一步測定了脂質攝取、DNL和脂肪酸氧化。結果顯示，SMPD3缺失的原代肝細胞脂質攝取明顯降低，而DNL和脂肪酸氧化不受影響。Huh-7細胞實驗也得到一致結果：SMPD3敲低抑制脂質攝取速率，SMPD3過表達則增強脂質攝取。在體內實驗中，HKO小鼠肝臟對脂肪示蹤劑C12-BODIPY的攝取減少；重新引入野生型SMPD3可逆轉這一現(xiàn)象，而引入水解失活型SMPD3D428A,K433A突變體則不能逆轉。重要的是，各組血清C12-BODIPY水平并未受到影響，提示肝臟脂質攝取下降并不會改變系統(tǒng)性脂質分布。此外，補充神經酰胺可恢復HKO小鼠原代肝細胞和肝臟中的脂質攝取。上述結果表明，SMPD3通過增強脂質攝取促進脂質積累。

SMPD3通過改變質膜鞘磷脂/神經酰胺平衡調控小窩內吞

SMPD3是一種定位于質膜的酶，可在細胞應激狀態(tài)下將鞘磷脂水解為神經酰胺。與此一致，研究者觀察到，與胞質組分相比，SMPD3在膜組分中特異性富集。Smpd3敲除肝臟RNA測序和原代肝細胞蛋白質組學分析顯示，SMPD3破壞主要影響質膜相關蛋白和結構區(qū)域，例如微結構域、細胞囊泡和內體。

為了明確SMPD3在質膜上的功能，研究者對SMPD3共免疫沉淀產物進行了蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)其與膜蛋白復合體和膜筏存在相互作用，尤其是在肝細胞中與小窩結構蛋白caveolin-1（CAV1）和caveolin-2（CAV2）相互作用。免疫熒光染色進一步證實，棕櫚酸（PA）誘導的脂毒性可增強SMPD3表達，并促進SMPD3與質膜小窩共定位。在過表達帶標簽SMPD3、CAV1和CAV2的HEK 293T細胞中，研究者進一步驗證了這些相互作用。類似相互作用也存在于MASH肝臟樣本中。

小窩是質膜上富含膽固醇和鞘脂的小型內陷結構，參與小窩介導的內吞和脂質轉運。透射電鏡（TEM）和RAB5A染色顯示，脂質負荷可顯著增加小窩和內吞囊泡數(shù)量，而SMPD3敲低可減少這一變化。這提示SMPD3可能通過調控小窩介導的內吞，進而影響肝細胞脂質攝取。

為了驗證這一假設，研究者進行了脂肪酸攝取實驗。首先，使用dynasore抑制內吞后，SMPD3缺失肝細胞中脂質攝取下降的現(xiàn)象被消除，支持其機制依賴內吞過程。其次，通過過表達CAV1、CAV2或二者同時過表達來增加小窩數(shù)量，可顯著增強脂質攝?。坏@一作用可被SMPD3敲低或SMPD3抑制劑DPTIP完全消除。相反，SMPD3過表達促進脂質攝取，而敲低CAV1或CAV2則抑制這一作用。這些結果表明，SMPD3在小窩依賴性脂質攝取中發(fā)揮關鍵作用。

研究者隨后進一步探討SMPD3的質膜定位和酶活性是否為該過程所必需。截短SMPD3的N端膜錨定結構域會破壞其與CAV1和CAV2的相互作用，削弱鞘磷脂水解，并減少脂質攝取。此外，人源SMPD3催化位點突變（K435A）雖然保留了與CAVs的相互作用，但阻礙了有效脂質攝取。以上結果提示，SMPD3的酶活性和質膜定位對于調控小窩依賴性脂質攝取都是必要的。通過改變小窩中的鞘磷脂-神經酰胺平衡，SMPD3促進內吞囊泡從質膜彎曲并脫離，從而推動脂質攝取。

圖3：SMPD3通過改變肝細胞質膜原位脂質組成，調控小窩內吞并促進脂質攝取。（A和I）實驗示意圖。（B）C12-BODIPY攝??；比例尺，10 μm。（C）[1-14C]-PA攝取速率，n = 4/組。（D）原代肝細胞DNL和脂肪酸氧化速率，n = 4/組。（E–G）SMPD3敲低（E）或過表達（F）后Huh-7細胞攝取C12-BODIPY的熒光強度，n = 4/組；以及MASH小鼠血清和肝臟中C12-BODIPY攝取的熒光強度（G），n = 3/組。（H）從MASH小鼠分離的肝細胞膜組分和胞質組分中SMPD3的代表性免疫印跡，n = 3/組。（J和K）在6×His-SMPD3組相對于載體組中，強度位于前50%且倍數(shù)變化（FC）≥ 2的蛋白，其最顯著富集的GO細胞組分（GO-CC）通路（J）及蛋白（K）。（L）Huh-7細胞質膜上SMPD3與小窩的共定位，小窩以CAV1標記；比例尺，10 μm。（M）肝臟裂解液中SMPD3共免疫沉淀（coIP）實驗。（N）Huh-7細胞頂端膜小窩的透射電鏡（TEM）圖像；比例尺，0.5 μm，n = 3–5/組。（O）Huh-7細胞中RAB5A早期內體標志物的免疫熒光染色；比例尺，10 μm。（P）經或未經dynasore處理的原代肝細胞攝取C12-BODIPY的熒光強度，n = 3/組。（Q）在轉染載體或SMPD3質粒并伴隨CAV1或CAV2敲低的Huh-7細胞中，C12-BODIPY攝取情況；比例尺，10 μm。（R）SMPD3截短和突變示意圖。（S和T）表達全長、截短型或突變型SMPD3的Huh-7細胞中C12-BODIPY攝取情況；比例尺，10 μm。（U）機制示意總結。數(shù)據以均值 ± SEM表示。兩組之間采用非配對Student’s t檢驗；多組之間采用單因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S4。

SMPD3通過調控胞外囊泡釋放促進肝纖維化和炎癥

脂毒性是MASL進展為MASH的重要標志，可觸發(fā)肝內炎癥和纖維化。在代謝應激下，脂肪變性肝細胞會釋放具有病理作用的胞外囊泡（EVs），并通過這些囊泡與非實質細胞溝通，包括巨噬細胞和肝星狀細胞（HSCs），進而啟動炎癥和纖維化反應。SMPD3可生成錐形脂質神經酰胺，促進膜出芽和腔內囊泡形成，因此對EV生物發(fā)生非常關鍵。與這一功能一致，RNA測序數(shù)據顯示，SMPD3缺失可抑制肝臟炎癥和纖維化。

細胞類型解卷積分析進一步顯示，HKO可顯著減少MASH肝臟中的非實質細胞，包括巨噬細胞和肝星狀細胞。為了檢測SMPD3缺失是否影響MASH過程中的EV產生，研究者從GAN飲食小鼠肝臟中分離EV。結果顯示，與FLOX對照相比，HKO小鼠肝源性EV產生顯著減少，無論是小EV群體（<200 nm）還是中/大EV群體（>200 nm）均下降。HKO小鼠來源EV中，EV標志物CD63和肝細胞標志物白蛋白水平降低，進一步證實肝源性EV減少。脂質刺激Huh-7細胞后的TEM結果也支持這一觀察，即SMPD3敲低可減少EV產生。

為了明確SMPD3如何影響肝細胞與非實質細胞之間的通訊，研究者首先用PA刺激FLOX或HKO肝細胞，并收集條件培養(yǎng)基（CM），再處理小鼠原代HSC和骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）。與FLOX-CM相比，HKO-CM削弱了HSC活化，表現(xiàn)為Acta2 mRNA表達下降。Acta2編碼HSC活化標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）。同時，HKO-CM促使巨噬細胞向抗炎M2表型偏移。流式細胞術也顯示，HKO-CM降低M1/M2巨噬細胞比例，提示促炎巨噬細胞減少而抗炎巨噬細胞增加。

體內結果與體外實驗一致。GAN飲食HKO小鼠肝臟中α-SMA陽性HSC減少，CD80陽性M1巨噬細胞減少，CD206陽性M2巨噬細胞增多。重新引入SMPD3可逆轉這些變化，提示肝細胞中的SMPD3在影響肝臟微環(huán)境中巨噬細胞極化和HSC活化方面具有重要作用。

為了判斷這些效應是否由肝細胞分泌的EV介導，研究者分別分離肝源性和肝細胞來源EV，并直接刺激BMDMs和JS-1細胞（一種小鼠HSC細胞系）。結果與條件培養(yǎng)基實驗一致：與FLOX-EVs相比，來自肝細胞培養(yǎng)物或肝臟的HKO-EVs均可明顯降低JS-1細胞中纖維化相關基因及α-SMA蛋白表達，并抑制BMDMs中的M1/M2巨噬細胞極化。去除EV的條件培養(yǎng)基不能影響巨噬細胞極化或HSC活化，進一步確認這些作用由EV介導。重要的是，使用Proteinase K（PK）消化FLOX-EVs中的蛋白成分后，其促炎和促纖維化作用消失，同時FLOX來源EV與HKO來源EV之間的差異也被消除。這提示SMPD3通過肝細胞來源EV中的蛋白貨物促進肝纖維化和炎癥。

進一步分析脂肪變性肝細胞相關分泌組基因后，研究者發(fā)現(xiàn)Smpd3敲除后有12個分泌因子下調。其中，編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白8B（BMP8B）的基因下降最顯著。值得注意的是，HKO小鼠肝細胞來源EV和肝源性EV中的BMP8B水平也明顯降低。BMP8B屬于轉化生長因子β（TGF-β）超家族，既往研究提示其可通過BMP-TGF-β通路使HSC轉分化為肌成纖維細胞，從而加重MASH進展。重要的是，在TGF-β超家族成員中，BMP8B是唯一一個由脂毒性誘導，并在HKO小鼠肝細胞或肝臟中持續(xù)降低的成員?？傮w而言，這些結果表明，脂肪變性肝細胞中SMPD3上調，可通過EV攜帶包括BMP8B在內的促炎、促纖維化貨物，促進其與鄰近細胞通訊，從而加重MASH微環(huán)境改變。

圖4：肝細胞中SMPD3缺失削弱EV介導的纖維化和炎癥。（A）從MASH肝臟分離的EV蛋白濃度，n = 6–8/組。（B）從FLOX和HKO小鼠血清中分離EV后，檢測CD63、calnexin和白蛋白的免疫印跡。（C）SMPD3敲低后Huh-7細胞分泌EV的透射電鏡圖像。（D、H和L）實驗示意圖。（E和F）纖維化相關基因（E）和炎癥相關基因（F），n = 3–4/組；通過流式細胞術檢測BMDMs中M1/M2巨噬細胞極化比例，n = 3/組。（G）肝組織切片中α-SMA、CD80和CD206的代表性染色；α-SMA比例尺，100 μm；CD80和CD206比例尺，40 μm。（I、J、M和N）JS-1細胞中纖維化相關基因表達及α-SMA免疫印跡。（K和O）BMDMs培養(yǎng)基中的細胞因子水平。（P–R）原代肝細胞（Q）或MASH肝臟（R）中與肝臟分泌因子相關差異表達基因的韋恩圖（P）和熱圖。（S）肝細胞來源EV和肝源性EV中BMP8B貨物裝載的免疫印跡。（T）機制示意總結。數(shù)據以均值 ± SEM表示。采用非配對Student’s t檢驗。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S5。

藥理學抑制SMPD3改善飲食誘導的MASH

在遺傳學證據的基礎上，研究者進一步評估了藥理學靶向SMPD3的治療潛力。DPTIP是一種可口服的SMPD3抑制劑，已顯示可劑量依賴性阻斷細胞EV釋放。當DPTIP用于已經建立MASH的小鼠時，可顯著抑制肝臟SMPD3活性，表現(xiàn)為Cer/SM比值和EV釋放下降。DPTIP干預后，小鼠MASH病理得到明顯改善。組織學分析進一步證實了其作用，包括NAS評分下降、M1/M2巨噬細胞極化降低，以及肝纖維化明顯緩解。

為了評估DPTIP處理結果與人類MASH嚴重程度之間的對應關系，研究者將DPTIP處理小鼠的基因表達譜與人類MASH數(shù)據集進行比較。結果顯示，DPTIP可顯著改善小鼠MASH嚴重程度，使其表達譜從較進展階段（F2-F3）轉向較早的纖維化前階段（F0-F1），甚至接近MASL。通路分析顯示，DPTIP下調炎癥和纖維化相關通路，同時影響與膜筏和微結構域相關的細胞功能。此外，DPTIP還降低了參與MASH進展的多類非實質細胞豐度，包括巨噬細胞、樹突狀細胞和肝星狀細胞。總體來看，這些結果支持SMPD3作為MASH治療潛在靶點。

圖5：DPTIP藥理學抑制SMPD3可改善MASH。（A）實驗示意圖，n = 5–10/組。（B）肝臟中神經酰胺、SM和Cer/SM比值。（C）DPTIP處理小鼠肝臟分離EV的相對數(shù)量，n = 4/組。（D）肝臟重量。（E）血清ALT和AST。（F）肝臟TG、TC和HYP。（G）肝組織切片代表性H&E、油紅O、天狼星紅、α-SMA、CD80和CD206染色，以及NAS評分；α-SMA比例尺，100 μm；CD80和CD206比例尺，20 μm。（H）基于20個人類MASH嚴重程度同源特征基因表達，通過PCA和聚類分析展示患者MASLD進展以及DPTIP處理MASH小鼠的疾病狀態(tài)；所有聚類均采用歐氏距離。（I和J）小鼠肝臟GO生物過程（GO-BP）和GO細胞組分（GO-CC）富集分析。（K）肝臟NPCs的ssGSEA評分。數(shù)據以均值 ± SEM表示。兩組之間采用非配對Student’s t檢驗；多組之間采用單因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

脂毒性誘導的DNA損傷通過抑制SIRT1上調SMPD3

鑒于SMPD3缺失可改善MASH，研究者進一步追問：在疾病進展過程中，是什么因素驅動SMPD3上調？為模擬MASH相關應激，研究者使用多種與MASH病理相關的葡萄糖、脂質和應激刺激處理肝細胞。結果顯示，脂毒性棕櫚酸（PA）和DNA損傷誘導劑阿霉素（Dox）最明顯地增加細胞死亡，并誘導SMPD3 mRNA和蛋白水平升高。公共GEO數(shù)據集的GSEA結果顯示，人類MASLD肝臟中DNA損傷和修復相關通路富集，提示DNA損傷可能參與MASH進展。

以磷酸化γH2A.X（p-γH2A.X）增強作為DNA損傷標志，研究者發(fā)現(xiàn)PA和Dox處理均可在肝細胞中觸發(fā)鞘磷脂水解，這可能與SMPD3表達升高有關。其他DNA損傷誘導劑，包括phenazine（Phen）、順鉑（Cis）和博來霉素（Bleo），同樣可升高SMPD3 mRNA表達。在肝細胞和MASH小鼠肝臟樣本中，DNA損傷與質膜結合型SMPD3上調之間的關聯(lián)也得到確認，提示脂毒性相關DNA損傷可能是MASH中SMPD3轉錄激活的關鍵驅動因素。

DNA損傷會激活多聚ADP核糖聚合酶1（PARP1），該酶是重要DNA修復酶，但會快速消耗NAD+。與此一致，PA和Dox處理可提高肝細胞PARP活性，并顯著降低NAD+水平。PARP抑制劑可逆轉這些效應，并降低SMPD3表達。由于PARP1和SIRTs共同依賴NAD+作為輔因子，并在細胞應激下調節(jié)生存與死亡通路，研究者提出假設：PARP誘導的NAD+消耗可能抑制SIRT活性。

通過熒光素酶報告系統(tǒng)，研究者發(fā)現(xiàn)SIRT1是SMPD3轉錄的重要抑制因子。使用SIRT1激動劑SRT可下調SMPD3表達，而使用SIRT1抑制劑煙酰胺（NAM）則促進SMPD3表達。與此一致，PA和Dox處理可降低肝細胞NAD+水平和SIRT1活性，這與MASL和MASH小鼠中的觀察相吻合；其中，SIRT1抑制特異性出現(xiàn)在MASH階段。MASH肝臟樣本中H3K9和H4K16乙?；黾?，也支持SIRT1活性下降。進一步實驗顯示，過表達野生型SIRT1可抑制SMPD3表達，而失活突變體H363Y無此作用。染色質免疫沉淀（ChIP）實驗證實，SIRT1可降低SMPD3啟動子上H3K9Ac和H4K16Ac富集，提示其具有直接轉錄抑制作用。在體內，抑制SIRT1會加重肝損傷并上調SMPD3，而激活SIRT1則可逆轉這些效應。

這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了一條新的病理級聯(lián)反應：脂毒性誘導DNA損傷，激活PARP，消耗NAD+，繼而抑制SIRT1活性，最終導致SMPD3上調并促進MASH進展。

圖6：脂毒性誘導的DNA損傷通過抑制SIRT1導致SMPD3轉錄上調。（A–C）原代肝細胞中SMPD3和p-γH2A.X的免疫印跡。（D）原代肝細胞中神經酰胺和Cer/SM比值，n = 3/組。（E）Huh-7細胞膜組分和胞質組分中SMPD3的免疫印跡。（F）小鼠肝臟中SMPD3和p-γH2A.X的免疫印跡，n = 4/組。（G–J）在PA和Dox刺激并聯(lián)合PARP抑制劑AIQ和PJ34處理的Huh-7細胞中，檢測SMPD3 mRNA、細胞NAD+以及PAR和SMPD3表達，n = 3/組。（K）不同SIRTs對HEK 293T細胞中SMPD3啟動子活性的影響，n = 4/組。（L）SRT1720和NAM對Huh-7細胞、原代肝細胞和L02細胞中SMPD3轉錄的調控，n = 3/組。（M和N）Huh-7細胞中的NAD+水平和SIRT1活性（M，n = 4/組），以及MASH小鼠肝臟中的NAD+水平和SIRT1活性（N，n = 6–7/組）。（O）小鼠肝臟中SIRT1、SMPD3、H4K16Ac和H3K9Ac的免疫印跡，n = 3/組。（P和Q）L02細胞中SIRT1活性和SMPD3 mRNA表達，n = 3/組，以及SIRT1和SMPD3的免疫印跡。（R）Huh-7細胞中SMPD3啟動子區(qū)域H3K9Ac和H4K16Ac富集的ChIP-qPCR分析，n = 3/組。（S）機制示意總結。數(shù)據以均值 ± SEM表示。兩組之間采用非配對Student’s t檢驗；多組之間采用單因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S6和圖S7。

靶向SIRT1-SMPD3軸的雙功能分子DC17緩解MASH

SIRT1缺失與MASH密切相關，而激活SIRT1可緩解疾病。由于SIRT1活性下降是MASH中SMPD3上調的重要驅動因素，研究者提出，若能設計一種同時靶向SIRT1-SMPD3軸的雙功能分子，充分阻斷SMPD3的致病作用，可能成為MASH治療的新策略。

DPTIP和SIRT1激活劑20b具有相似的結構框架，均由疏水尾部、連接臂和極性頭部三個關鍵部分組成。分子對接分析顯示，疏水尾部可有效占據P1口袋，含氮連接臂形成氫鍵，而極性頭部深入富含極性氨基酸的P2口袋?；谶@些相似性，研究者設計了一系列預計可同時激活SIRT1并抑制SMPD3的化合物。對DC系列化合物進行SMPD3抑制活性篩選后，DC17被確定為最強抑制劑。與20b和DPTIP的結合模式一致，DC17可充分占據極性P1口袋和疏水P2口袋，并通過連接臂形成氫鍵。值得注意的是，DC17對SMPD3的抑制效力強于陽性對照GW4869，同時也能顯著激活SIRT1。

為了評估DC17對MASH的治療效果，并判斷其獲益來源于雙功能特性，還是主要來自SIRT1激動或SMPD3抑制中的某一方面，研究者在已建立的MASH模型中比較了DC17、20b和DPTIP。20b和DC17均可降低肝臟SMPD3表達，但DC17還能進一步抑制殘余SMPD3酶活性。因此，在改善MASH關鍵表型方面，DC17優(yōu)于20b和DPTIP。這些結果說明，同時靶向兩個通路具有協(xié)同獲益。

為了進一步驗證DC17是否通過SIRT1-SMPD3軸發(fā)揮作用，研究者在SMPD3 FLOX和HKO小鼠中檢測DC17效應。在DC17處理的HKO小鼠中，MASH表型相較于載體處理HKO小鼠并未進一步改善，提示SMPD3活性對于DC17治療MASH的作用是不可或缺的。值得注意的是，在該實驗中，小鼠接受GAN飲食34周以建立進展期MASH后才開始DC17治療。DC17顯示出較強療效，并有效逆轉了MASH相關病理改變，進一步支持SIRT1-SMPD3軸是晚期MASH潛在治療靶點。

圖7：靶向SIRT1-SMPD3軸的雙功能分子DC17可緩解MASH。（A）雙功能DC系列化合物的設計策略。（B）以GW4869作為陽性對照，檢測所選分子對SMPD3的抑制作用，n = 3–4/組。（C）DC17與SMPD3（PDB: 5UVG）和SIRT1（PDB: 4I5I）的預測結合模式。（D）DC17對SMPD3的抑制作用，并以GW4869作為陽性對照，n = 3/組；DC17對SIRT1的激活活性，以SRT501和20b作為陽性對照，以DPTIP作為陰性對照，n = 3/組。（E）實驗示意圖，n = 7/組。（F）肝臟SMPD3、H4K16Ac和H3K9Ac的免疫印跡。（G）肝臟中神經酰胺、SM和Cer/SM比值。（H）血清ALT和TG。（I）肝臟TG、TC和HYP。（J和K）肝組織切片代表性H&E、油紅O、天狼星紅，以及α-SMA、CD80和CD206染色，并進行NAS評分；α-SMA比例尺，100 μm；CD80和CD206比例尺，25 μm。數(shù)據以均值 ± SEM表示。采用非配對Student’s t檢驗。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S7。

【貢獻】★★★★★

目前針對MASH的治療，尤其是以降低總體脂肪積累為目標的策略，在阻止MASL向MASH進展方面效果仍有限。本研究確定SMPD3是連接脂毒性與MASH的關鍵節(jié)點，它整合了脂毒性、炎癥和纖維化等重要疾病特征。通過介導質膜鞘磷脂水解，SMPD3促進脂質攝取和胞外囊泡釋放，從而驅動MASH進展。

抑制SMPD3，尤其是通過DC17這類雙靶向化合物進行干預，為進展期MASH提供了一種有前景的治療思路，也回應了當前臨床中尚未滿足的重要需求。未來，進一步開發(fā)同工型特異性、肝臟靶向、代謝穩(wěn)定性更好的SMPD3抑制劑，或探索多靶點干預藥物，將有助于推動有效MASH治療策略的發(fā)展。

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