今天分享一篇在著名期刊Phytomedicine上,廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥研究廣州重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室\廣州中醫(yī)藥大學(xué)廣東中草藥囊泡工程研究中心等團(tuán)隊(duì)發(fā)表“Epimedium brevicornu Maxim.-derived extracellular vesicle-like particles stimulate VEGF-mediated angiogenesis to alleviate postmenopausal osteoporosis”的研究論文。

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絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）是一種可引發(fā)脆性骨折的骨骼疾病，影響全球數(shù)百萬(wàn)絕經(jīng)后女性。淫羊藿（EpimediumbrevicornuMaxim.，EP）具有抗骨質(zhì)疏松潛力，但其活性成分與作用機(jī)制尚不明確。淫羊藿源胞外囊泡樣顆粒（EPEVLPs）是天然存在的生物活性組分，目前尚無(wú)研究全面闡明EPEVLPs在PMOP中的雙重調(diào)控作用。目的：探究EPEVLPs對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的骨靶向能力與治療效果。方法：采用差速超速離心法從新鮮淫羊藿葉片中分離EPEVLPs，并通過(guò)透射電鏡、納米顆粒跟蹤分析、SDSPAGE、瓊脂糖凝膠電泳、薄層色譜、高效液相色譜進(jìn)行系統(tǒng)表征。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型體內(nèi)評(píng)估骨靶向特異性、抗骨質(zhì)疏松活性與生物相容性。體外實(shí)驗(yàn)包括：（1）通過(guò)免疫組化染色與RTqPCR評(píng)估人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）與MC3T3細(xì)胞的成骨分化；（2）通過(guò)CCK8與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）增殖與凋亡；（3）通過(guò)生物信息學(xué)分析、劃痕愈合、Transwell遷移、管形成實(shí)驗(yàn)與ELISA評(píng)估血管生成潛能。結(jié)果：從淫羊藿中分離得到杯狀雙層納米結(jié)構(gòu)的EPEVLPs，包含核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、淫羊藿次苷C及關(guān)鍵抗骨質(zhì)疏松化合物（淫羊藿苷）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示其優(yōu)先富集于骨質(zhì)疏松股骨，有效減輕骨丟失且無(wú)肝腎毒性。機(jī)制上，EPEVLPs以劑量依賴性方式上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)，增強(qiáng)HUVECs增殖、遷移與管形成。這種由血管生成驅(qū)動(dòng)的骨血管微環(huán)境重塑與骨穩(wěn)態(tài)恢復(fù)相關(guān)。結(jié)論：本研究證實(shí)EPEVLPs通過(guò)淫羊藿苷介導(dǎo)激活VEGF依賴性血管生成，從而改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。該植物源納米平臺(tái)通過(guò)血管再生偶聯(lián)成骨作用恢復(fù)骨穩(wěn)態(tài)，為靶向治療提供了具有轉(zhuǎn)化前景的新策略。

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絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）是一種以絕經(jīng)后雌激素急劇下降導(dǎo)致骨量減少為特征的全身性骨骼疾病。隨著女性年齡增長(zhǎng)，骨丟失呈漸進(jìn)性、隱匿性發(fā)生，導(dǎo)致骨密度與骨強(qiáng)度下降、脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)升高，進(jìn)而降低預(yù)期壽命。目前骨質(zhì)疏松的藥物治療包括雙膦酸鹽、雷洛昔芬、降鈣素、雌激素、地諾單抗與合成代謝藥物（ArceoMendoza&Camacho，2021）。然而，頜骨壞死、骨轉(zhuǎn)換抑制引發(fā)的非典型股骨骨折、心房顫動(dòng)等不良反應(yīng)限制了這些藥物的長(zhǎng)期使用。此外，雌激素替代治療會(huì)升高靜脈血栓栓塞等不良事件風(fēng)險(xiǎn)。綜上，亟需開(kāi)發(fā)天然、安全的骨質(zhì)疏松干預(yù)手段。

植物源胞外囊泡樣顆粒（PEVLPs）是從天然植物中分離的囊泡樣納米顆粒，因其來(lái)源豐富、免疫原性低、活性顯著等優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注。PEVLPs天然富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA等生物活性分子，其優(yōu)異的生物相容性、組織穿透性與理化穩(wěn)定性使其可作為生物治療劑與藥物遞送系統(tǒng)。此外，PEVLPs可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)遞送，改善活性成分生物利用度不足的問(wèn)題并提升生物安全性。研究表明，人參源胞外囊泡樣顆粒（GEVLPs）可與切除的自體腫瘤細(xì)胞膜雜交形成功能化雜交囊泡（HMNPs）并用作疫苗，通過(guò)HMNPs免疫可降低術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)保持良好生物相容性。本團(tuán)隊(duì)前期兩項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)（RD）與巴戟天（MO）源胞外囊泡樣顆粒均表現(xiàn)出良好的骨組織靶向活性與抗骨質(zhì)疏松作用，可逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松。此外，山藥源EVLPs經(jīng)小鼠口服給藥可促進(jìn)骨再生且具有良好的全身生物安全性。

淫羊藿（EpimediumbrevicornuMaxim.，EP），俗稱仙靈脾，為小檗科多年生草本植物，其干燥地上部分入藥。作為中醫(yī)藥數(shù)千年來(lái)的核心藥材，淫羊藿因“補(bǔ)腎益精、強(qiáng)筋健骨”的傳統(tǒng)功效被廣泛用于PMOP治療。現(xiàn)代藥理研究已鑒定其生物活性成分，包括主要黃酮類成分淫羊藿苷、黃酮、木脂素、生物堿與揮發(fā)油。值得注意的是，新興研究聚焦于闡明淫羊藿抗骨質(zhì)疏松活性的分子機(jī)制，尤其是淫羊藿苷及相關(guān)化合物介導(dǎo)的破骨細(xì)胞抑制與成骨細(xì)胞激活。

本研究從新鮮淫羊藿葉片中分離純化高產(chǎn)量的淫羊藿源胞外囊泡樣顆粒（EPEVLPs），并從生物活性成分新角度探究其作用機(jī)制，闡明淫羊藿的抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)。

1.EPEVLPs的理化表征

EPEVLPs呈現(xiàn)典型的杯狀雙層膜結(jié)構(gòu)形態(tài)特征（圖1A），粒徑分布在50–150nm之間（圖1B）。如圖1C所示，EPEVLPs對(duì)TritonX100濃度升高呈濃度依賴性響應(yīng)，當(dāng)TritonX100濃度升至0.1%時(shí)，顆粒濃度低于10%，表明EPEVLPs純度高于90%。EPEVLPs主要包含小分子量RNA、小分子量蛋白（10–35kDa）與多種脂質(zhì)（圖1D–F），提示其可能通過(guò)RNA、蛋白與脂質(zhì)組分參與細(xì)胞間通訊并介導(dǎo)生物學(xué)過(guò)程。樣品色譜圖中出現(xiàn)兩個(gè)特征峰（圖1G），與淫羊藿次苷C（圖1H）、淫羊藿苷（圖1I）標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)后，確認(rèn)這兩個(gè)特征峰分別對(duì)應(yīng)淫羊藿次苷C與淫羊藿苷。此外，通過(guò)納米顆粒跟蹤分析（NTA）對(duì)EPEVLPs進(jìn)行表征（主峰154nm），并通過(guò)小RNA測(cè)序鑒定出146個(gè)miRNA。代謝組學(xué)分析進(jìn)一步揭示了多類代謝物（補(bǔ)充圖S5）。

2.EPEVLPs的體內(nèi)分布與生物安全性

如圖2A–B所示，游離DiR染料與DiR標(biāo)記的EPEVLPs均逐漸在肝、脾、肺組織富集。靜脈給藥后，DiR與EPEVLPs在12h于肝、脾、肺中富集量最高，24h與48h逐漸下降；而灌胃給藥后，其在肝、脾、肺中的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間無(wú)明顯變化。值得注意的是，兩種給藥途徑下，股骨處熒光強(qiáng)度均隨時(shí)間升高，提示EPEVLPs可進(jìn)入體循環(huán)（即使口服給藥）并在股骨部位富集。如圖2C–F所示，EPEVLPs組與對(duì)照組血清ALT、AST、BUN、Crea水平無(wú)顯著差異（p>0.05）。HE染色顯示，對(duì)照組與EPEVLPs組主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）均無(wú)病理性損傷（圖2G），表明EPEVLPs具有良好的生物安全性。

3.EPEVLPs改善去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松

與假手術(shù)組相比，OVX組小鼠右側(cè)股骨顯微CT分析顯示股骨遠(yuǎn)端骨小梁結(jié)構(gòu)顯著破壞（圖3A），提示EPEVLPs對(duì)PMOP具有治療潛力。定量分析顯示（圖3B），OVX組BMD、BV、BV/TV（%）、Tb.N顯著低于假手術(shù)組（p<0.01），而SMI、Tb.Sp顯著高于假手術(shù)組（p<0.01），證實(shí)OVX模型構(gòu)建成功。值得注意的是，高劑量EPEVLPs顯著逆轉(zhuǎn)去卵巢誘導(dǎo)的骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂（圖3A）；與未處理OVX對(duì)照組相比，EPEVLPs給藥顯著減輕骨丟失，表現(xiàn)為BMD、BV、BV/TV、Tb.N升高（p<0.05），SMI、Tb.Sp降低（p<0.05）。低劑量EPEVLPs對(duì)絕經(jīng)后小鼠骨質(zhì)疏松療效有限，僅使BMD小幅提升（6.74%，p<0.05），BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Sp、SMI等關(guān)鍵微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)無(wú)顯著改善（與OVX組相比均p>0.05），因此后續(xù)組織學(xué)分析（圖3C–F）僅聚焦高劑量組，探究骨再生的潛在機(jī)制。免疫組化分析顯示，與OVX組相比，EPEVLPs處理顯著升高骨組織中ALP與OCN表達(dá)（p<0.05；圖3C–F）。

4.EPEVLPs體外不直接促進(jìn)成骨

補(bǔ)充圖S1A–B顯示，當(dāng)濃度不高于1×101?particles/mL時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性，且EPEVLPs既不促進(jìn)也不抑制hBMSCs與MC3T3E1細(xì)胞增殖。茜素紅染色顯示，EPEVLPs處理未增加hBMSCs或MC3T3E1細(xì)胞的鈣沉積（補(bǔ)充圖S1C）。RUNX2、OCN、BMP2是成骨分化過(guò)程中的關(guān)鍵成骨細(xì)胞標(biāo)志物，基因表達(dá)分析顯示，EPEVLPs處理后hBMSCs與MC3T3E1細(xì)胞中RUNX2、OCN、BMP2基因水平穩(wěn)定（補(bǔ)充圖S1D–I）。以上結(jié)果提示EPEVLPs不直接促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化，其抗骨質(zhì)疏松作用可能通過(guò)其他途徑介導(dǎo)。

5.EPEVLPs的代謝組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)關(guān)聯(lián)分析

為探究EPEVLPs治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，本研究結(jié)合代謝組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建藥物成分
疾病靶點(diǎn)整合網(wǎng)絡(luò)，隨后通過(guò)分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、表面等離子體共振（SPR）評(píng)估藥物成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合親和力與穩(wěn)定性。在EPEVLPs與淫羊藿中共同鑒定出11種活性成分：淫羊藿次苷C、淫羊藿苷、箭藿苷A、淫羊藿苷A、淫羊藿定C、淫羊藿定B、胡薄荷酮、甲基丁香酚、酪醇、仙靈藿苷D、己糖苷E（圖4A）。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，箭藿苷A、淫羊藿苷、淫羊藿定B、淫羊藿次苷C是EPEVLPs中11種共有成分中含量最高的四種（圖4B）。此外，淫羊藿苷與淫羊藿次苷C的101個(gè)靶點(diǎn)基因與骨質(zhì)疏松相關(guān)（圖4C）。KEGG通路富集分析顯示，這些靶點(diǎn)基因顯著富集于VEGF信號(hào)通路（圖4D）。網(wǎng)絡(luò)分析表明，EPEVLPs與淫羊藿中的多數(shù)共有成分與骨質(zhì)疏松核心信號(hào)靶點(diǎn)相關(guān)（圖4E）。PPI網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步確定VEGFR（VEGF受體）是骨質(zhì)疏松相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白（圖4F）。分子對(duì)接顯示，仙靈藿苷D、淫羊藿定B、箭藿苷A、淫羊藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿苷A的結(jié)合活性優(yōu)于其他EPEVLPs成分（結(jié)合能<?8.2kcal/mol）（圖4G，補(bǔ)充圖S2）。淫羊藿苷作為淫羊藿的主要黃酮活性成分，在EPEVLPs代謝組學(xué)分析中平均表達(dá)量位居第二，且廣泛用于骨相關(guān)疾病治療（Si等，2024；Zhang等，2022），同時(shí)被《中國(guó)藥典》列為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，因此選擇淫羊藿苷作為目標(biāo)生物活性分子開(kāi)展研究。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示淫羊藿苷與VEGFR2結(jié)合穩(wěn)定，提示其潛在生物活性（補(bǔ)充圖S3）。SPR證實(shí)淫羊藿苷與VEGFR2受體特異性結(jié)合（KD=2.47e?4M），驗(yàn)證其對(duì)VEGF通路的靶向作用（圖4H）。

6.EPEVLPs對(duì)HUVECs的細(xì)胞毒性及體外/體內(nèi)內(nèi)化

凋亡與CCK8實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞毒性顯示，EPEVLPs在濃度低于1×1012particles/mL時(shí)對(duì)HUVECs無(wú)顯著凋亡誘導(dǎo)作用，生物安全性優(yōu)異（圖5A）。CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，EPEVLPs對(duì)HUVECs具有劑量依賴性增殖作用，但濃度達(dá)1×1012particles/mL時(shí)細(xì)胞活力顯著下降（圖5B）。

為驗(yàn)證細(xì)胞攝取，將DiI標(biāo)記的EPEVLPs與HUVECs共孵育8h，流式細(xì)胞術(shù)顯示各濃度組內(nèi)化率均>90%（圖5C）。熒光顯微鏡觀察（圖5D–E）顯示，DiI標(biāo)記的EPEVLPs（紅色）隨時(shí)間在細(xì)胞質(zhì)中累積，4h后出現(xiàn)大量?jī)?nèi)化，提示起效迅速。

同時(shí)探究EPEVLPs對(duì)體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，DiI標(biāo)記EPEVLPs組小鼠肝、腎、腹主動(dòng)脈、股骨組織均出現(xiàn)較強(qiáng)熒光信號(hào)（補(bǔ)充圖S4A）；腹主動(dòng)脈組織切片共聚焦圖像中觀察到EPEVLPs（紅色）與血管內(nèi)皮細(xì)胞（綠色）共定位（白色箭頭）（圖5F–G）。

7.EPEVLPs對(duì)血管生成的影響

為探究EPEVLPs對(duì)HUVECs遷移的影響，開(kāi)展劃痕愈合與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。如圖6A–B所示，EPEVLPs處理的內(nèi)皮細(xì)胞劃痕愈合增強(qiáng)，24h愈合率約30%–50%，顯著高于正常對(duì)照組（p<0.01）。Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)EPEVLPs顯著促進(jìn)HUVECs遷移（補(bǔ)充圖S4B）。內(nèi)皮細(xì)胞黏附、融合與管狀結(jié)構(gòu)形成是血管生成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此基于Matrigel的管形成實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，EPEVLPs在3、6、12h顯著加速HUVECs管狀網(wǎng)絡(luò)形成（圖6C）；累積管長(zhǎng)定量分析顯示，各時(shí)間點(diǎn)EPEVLPs組管長(zhǎng)均顯著更長(zhǎng)（圖6D）。以上結(jié)果表明，EPEVLPs通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞遷移與管形成促進(jìn)早期血管生成。

CD31是評(píng)估血管生成的血管內(nèi)皮標(biāo)志物，通過(guò)免疫組化評(píng)估EPEVLPs對(duì)OVX小鼠股骨CD31表達(dá)的影響。EPEVLPs組CD31表達(dá)顯著高于OVX組，OVX組顯著低于假手術(shù)組（p<0.05，圖6E–F）。綜上，EPEVLPs可直接促進(jìn)血管化，并通過(guò)增強(qiáng)血管生成發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

8.EPEVLPs通過(guò)VEGF信號(hào)通路促進(jìn)血管生成

PCR與ELISA結(jié)果分析（圖7A–B）顯示，EPEVLPs顯著上調(diào)HUVECs中VEGF的mRNA與蛋白水平。關(guān)鍵的是，加入臨床獲批的VEGF通路抑制劑貝伐珠單抗可有效抑制EPEVLPs誘導(dǎo)的VEGF上調(diào)，該抑制效應(yīng)在蛋白水平較轉(zhuǎn)錄水平更顯著（ELISA平均抑制率86%，PCR為27.69%）。以上結(jié)果共同表明，EPEVLPs主要通過(guò)激活VEGF信號(hào)通路促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)的血管化有助于改善骨微環(huán)境，最終緩解骨質(zhì)疏松（圖7C）。

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