JGG｜東北林大/沈陽農大王玉成團隊開發精準高效的蛋白質–DNA結合分析技術

蛋白質與DNA的相互作用是DNA復制、轉錄、重組與修復等關鍵核內生命過程得以實現的分子基礎。針對蛋白質–DNA相互作用的傳統研究方法存在局限性。體外實驗如electrophoretic mobility shift assay (EMSA)作為檢測蛋白質–DNA互作的常規方法，操作簡便、快速高效，但多采用體外重組蛋白，難以完整保留蛋白質天然的翻譯后修飾與空間結構；而體內實驗如chromatin immunoprecipitation (ChIP)雖能還原細胞內蛋白質真實生理狀態，但耗時長、步驟復雜、對抗體與實驗條件要求嚴格。因此，亟需發展兼具操作簡便與保留蛋白質天然狀態的檢測方法。

近日，Journal of Genetics and Genomics在線發表東北林業大學/沈陽農業大學王玉成教授團隊題為“Plant-based native electrophoretic shift immunoassay (PN-ESI) enables semi-in-vivo detection of native protein-DNA interactions”的研究論文。該研究開發的基于植物的非變性凝膠遷移免疫分析技術(PN?ESI)，兼具保留植物體內蛋白質真實生理狀態與體外生化檢測操作簡便、流程高效的雙重優勢，在近生理狀態下實現了蛋白質–DNA相互作用的精準、高效檢測。

該研究首先在植物體內瞬時表達帶標簽的目標蛋白，提取含目標蛋白的細胞核提取物后，與無標記的目標DNA片段進行體外結合反應，再經非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過免疫印跡完成蛋白質–DNA復合物的特異性檢測。在總核蛋白用量、DNA探針及其用量相同的條件下，PN-ESI的檢測靈敏度較傳統EMSA提升至少10倍，且檢測結果與ChIP相互印證。隨后，利用PN-ESI進一步檢測了預測的蛋白質(轉錄因子PdbSCL1和BpTCP20)與DNA的相互作用，同時進行了EMSA驗證。鑒于PN-ESI直接采用細胞核內的天然功能狀態的蛋白質，可最大程度保留磷酸化、乙?；汝P鍵翻譯后修飾狀態，為解析翻譯后修飾對蛋白質–DNA相互作用的調控效應提供了可靠技術支撐。

基于植物的非變性凝膠遷移免疫分析技術(PN-ESI)流程及檢測應用

綜上所述，該研究建立了一套快速、靈敏、可忠實反映蛋白質天然功能狀態的半體內檢測技術體系PN-ESI。該技術與EMSA和ChIP互為補充，可在近生理條件下解析蛋白質–DNA相互作用。

作者簡介

東北林業大學林木遺傳育種全國重點實驗室博士后王鵬宇為該論文第一作者，東北林業大學/沈陽農業大學王玉成教授為通訊作者。相關工作得到國家自然科學基金資助。