Nature Plants?|?澄清爭議，華中農大油菜團隊解析ROS1去甲基化機制并發現新功能

DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶，5mC）是最重要的表觀遺傳修飾之一，在植物生長發育中發揮關鍵作用；而DNA去甲基化對于維持全基因組適當的DNA甲基化水平至關重要。ROS1作為首個被報導的DNA去甲基化酶，其去甲基化機制與生物學功能一直是該領域的核心科學問題。然而，目前仍存在以下關鍵未解難題：1）由于ROS1蛋白DNA結合能力較弱，其全基因組結合圖譜與特征至今未知，極大限制了對其功能的全面理解；2）傳統觀點認為ROS1去甲基化的主導模式為主動模式，但該范式存在悖論——廣泛且頻繁的堿基切除修復嚴重威脅基因組穩定性；3）ROS1是否具有DNA去甲基化之外的功能仍有待闡明。

近日，華中農業大學油菜團隊趙倫教授聯合南方科技大學朱健康院士在Nature Plants發表題為“Occupancy-basedmechanismis thechiefmode of ROS1function inpreventing DNAhypermethylation”的研究論文。該研究以甘藍型油菜和擬南芥為對象，澄清了ROS1去甲基化機制的關鍵爭議，并解決了其與基因組穩定性的長期悖論；首次繪制了ROS1高質量全基因組結合圖譜，揭示ROS1作為染色質可及性關鍵標志與調控者的新功能；并進一步闡明了上述兩種功能之間的相關性與獨立性，從而重塑DNA去甲基化酶的功能認知框架。

ROS1調控擬南芥與油菜氣孔發育

ROS1在油菜氣孔發育中發揮重要調控功能。在甘藍型油菜中，ROS1有兩個同源拷貝，功能冗余。利用CRISPR/Cas9構建的bnaros1突變體表現為氣孔數目顯著增多且氣孔附近小細胞簇增多等表型。與之相比，擬南芥ros1-4突變體主要表現為小細胞簇增多(Yamamuro et al., Nature Communications. 2014)，表明ROS1在油菜中可能存在功能分化。

圖1. 甘藍型油菜bnaros1單突變體和雙突變體的氣孔發育表型

首次繪制ROS1高質量全基因組結合圖譜，揭示其為可及性染色質標記

精準鑒定ROS1全基因組結合位點對于全面理解其功能至關重要。盡管ChIP-seq被認為是鑒定全基因組組蛋白修飾和染色質相關蛋白結合位點的金標準，ROS1因DNA結合能力弱，其全基因組結合位點與特征至今未知。為應對這一挑戰，該團隊前期開發了高效、靈敏、普適于植物經濟器官與低豐度染色質相關蛋白的新技術aChIP（Zhang, et al., Nature Plants. 2024; 中國發明專利：CN117431294B）。鑒于在該領域取得的進展，近期受邀在《中國科學：生命科學》撰寫綜述《植物ChIP-seq技術的革新與應用》，系統總結技術進展，提出數據質量評價標準，并展望其在基因調控網絡解析與作物遺傳改良中的應用前景。

本研究利用aChIP技術在擬南芥和油菜中首次繪制了高質量的ROS1全基因組結合圖譜。整合表觀基因組分析表明，ROS1結合位點并非隨機分布，而與可及性染色質高度共定位；且在不同組織及基因型（如hda6）中，這一共定位模式保持穩定。據此，研究人員首次提出ROS1可作為可及性染色質的重要標記。支持這一觀點的是，ROS1在體內和體外均表現出非特異性DNA結合特性，這與其廣泛分布于可及性染色質區域以及缺乏典型序列特異性DNA結合結構域的特點一致。因此，ROS1可能并非像轉錄因子那樣通過特異性序列識別招募至基因組，這一發現拓展了ROS1與染色質相互作用的認知框架。

圖2. ROS1全基因結合位點（占位）與可及性染色質共定位。

N與C端結構域驅動ROS1家族蛋白差異性靶向可及性染色質

通過一系列結構域截短實驗證實，ROS1對可及性染色質的特異性結合不依賴CXXC結構域，而主要由N端（富含賴氨酸）與C端（含RRM）結構域介導，缺失任一結構域均會改變其結合模式。由于油菜兩個ROS1同源蛋白的N端高度保守，其結合模式保持一致；相比之下，ROS1家族的其他成員（DME、DML2、DML3）由于N端結構存在較大差異，其結合模式類似截短的ROS1，并偏向H3K4me3等特定活躍位點。這些結果表明，N端與C端結構域的差異是ROS1家族蛋白靶向分化的核心機制。

圖3. N端與C端結構域對于ROS1特異性靶向可及性染色質至關重要

ROS1僅直接調控約四分之一的DNA甲基化差異位點

先前普遍認為ROS1直接調控所有DNA甲基化差異位點（ros1-4 vs Col-0 hyper-DMR）。然而，本研究發現，絕大多數ROS1結合位點（Type I，約94%）在ros1-4突變體中仍保持低甲基化狀態，表明這些位點不受ROS1調控；ROS1僅直接結合并調控約25%的甲基化差異位點（Type II），其余約75%位點（Type III）缺乏明顯ROS1結合信號，應為間接調控。這些結果重塑了對ROS1調控功能及作用方式的認知：它僅直接調控少部分DNA甲基化差異位點，但可能在調控染色質可及性中發揮廣泛作用。

圖4. ROS1僅直接調控約四分之一的DNA甲基化差異位點

ROS1占位機制阻止RdDM招募，維持DNA低/無甲基化狀態

先前研究表明，ROS1拮抗RdDM（RNA-directed DNA methylation）維持基因組低/無甲基化狀態，但其分子機制尚不清楚。為此，本研究提出兩種假設：1）ROS1與RdDM同時靶向相同位點，一邊建立DNA甲基化一邊去除甲基化；2）ROS1通過占位阻止RdDM招募從而抑制DNA甲基化建立，使得RdDM僅在ROS1缺失時發揮作用。

本研究通過整合ROS1與NRPD1的全基因組結合圖譜及相關突變體的DNA甲基化數據，將RdDM相關位點劃分為兩類：I型位點為非ROS1靶位點，RdDM正常建立DNA甲基化；II型位點為拮抗位點，在野生型中幾乎沒有RdDM招募和DNA甲基化沉積，而在ROS1缺失后則被RdDM占據并建立甲基化。本研究結果支持“占位拮抗”模型（假設2），即ROS1通過占據靶位點阻止RdDM招募，從而維持基因組低/無甲基化狀態。該機制不僅揭示了ROS1拮抗RdDM維持DNA低/無甲基化狀態的分子基礎，也避免了全基因組頻繁堿基切除對基因組穩定性造成的巨大風險。

圖5. ROS1通過占位機制拮抗RdDM，維持DNA低/無甲基化狀態

ROS1去甲基化主導模式為“被動”，而非“主動”

DNA去甲基化對維持基因組正常甲基化水平至關重要，主要包括被動去甲基化和主動去甲基化兩種方式。被動去甲基化是指細胞復制過程中，甲基轉移酶不再維持甲基化，導致甲基化逐代“稀釋”；主動去甲基化則依賴DNA去甲基化酶直接切除甲基化堿基5mC并修復DNA。過去二十多年，傳統觀點認為ROS1主要通過糖苷酶/裂解酶活性直接去除5-甲基胞嘧啶（5mC），啟動堿基切除修完成主動去甲基化。然而，這一經典模型存在諸多爭議：其一，ROS1切除甲基化堿基的證據主要來自體外實驗，難以完全反映植物體內真實情況；其二，ROS1缺失后基因組出現廣泛高甲基化，表明其確實參與去甲基化，但具體機制尚不明確；其三，該模型無法解釋一個矛盾——若全基因組范圍內頻繁發生大規模堿基切除，基因組穩定性如何維持？

本研究通過體內實驗證實，ROS1去甲基化的主導模式為被動去甲基化。將971位天冬氨酸替換為丙氨酸，獲得糖苷酶/裂解酶缺陷型ROS1變體ROS1D971A，該突變體完全喪失5mC酶切活性。然而，ROS1D971A的全基因組占位模式與野生型一致，依然特異性靶向可及性染色質區域，表明其結合模式獨立于酶切活性。將ROS1D971A導入ros1-4突變體后，至少65%的位點DNA甲基化顯著降低。與此一致，ROS1D971A knock-in原位定點氨基酸替換材料中超過90%的位點顯示同樣的趨勢。這些結果表明，ROS1主要依賴占位機制而非酶切活性實現廣泛被動去甲基化，顛覆了長期以來“主動去甲基化主導”的傳統認知，并同時避免了全基因組頻繁切除堿基帶來的基因組穩定性風險。

圖6. ROS1去甲基化模式主要依賴占位機制的被動模式。

ROS1通過“現役—預備役”雙重策略保護可及性染色質

鑒于ROS1廣泛占據開放染色質區域，本研究解析了其調控染色質可及性的新功能，并提出其通過“現役—預備役”雙重策略發揮作用。當某位點是DNA甲基化系統靶位點且該甲基化系統活躍時，ROS1采取“現役”策略：既可獨立維持少量可及性位點，也可與其他表觀調控因子（如組蛋白乙酰轉移酶GCN5等）合作維持染色質可及性。相反，當該類位點暫時缺乏DNA甲基化系統作用時，ROS1采用“預備役”策略：一旦DNA甲基化系統重新建立或引入，ROS1則迅速轉為“現役”狀態發揮保護作用。由此，ROS1通過“現役—預備役”雙重策略，實現對所有可及性染色質區域的動態保護。

圖7. ROS1“現役”策略：獨自或與GCN5等表觀遺傳調控因子合作保護可及性染色質。

圖8. ROS1“預備役”策略保護可及性染色質

ROS1調控染色質可及性可依賴亦可獨立于DNA甲基化

以往研究表明，DNA甲基化與染色質可及性通常存在拮抗關系。本研究表明ROS1同時具備DNA去甲基化和染色質可及性調控功能，但二者關系尚不明確。本研究通過分析ros1-4突變體及不同組織的DNA甲基化與染色質可及性數據發現：在部分位點，ROS1調控染色質可及性依賴DNA甲基化的拮抗作用；而在另一部分位點，尤其是在不同組織間，ROS1調控染色質可及性時不依賴DNA甲基化。由此可見，ROS1的兩種功能既相互關聯又相對獨立，拓展了對DNA甲基化與染色質可及性關系的認知框架。

圖9. ROS1調控染色質可及性可依賴亦可獨立于DNA甲基化

綜上所述，本研究為植物表觀遺傳研究提供了重要數據資源，系統重塑了ROS1去甲基化模式認知框架，揭示了ROS1調控染色質可及性的新功能與雙重調控策略，并進一步解析了這兩種功能之間復雜關系，從機制層面深化了對表觀遺傳調控體系的理解，為相關機制研究與功能解析提供了新思路與新策略。

華中農業大學鄧利副教授和博士研究生朱光楓、鐘文瑩、賈志博為論文共同第一作者，華中農業大學趙倫教授和南方科技大學朱健康院士為通訊作者。華中農業大學傅廷棟院士、沈金雄教授、李國亮教授、周強偉副研究員、章清博士、司志鑫、張敏燕，深圳大學杜璇教授、中國科學院分子植物科學卓越創新中心毛妍斐研究員、揚州大學吳健副教授、南方科技大學梁亞峰博士等給予了重要支持。該研究得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、中國博士后科學基金等資助。

通訊作者簡介：趙倫，華中農業大學教授、博士生導師，作物遺傳改良全國重點實驗室、國家油菜工程技術研究中心、湖北洪山實驗室固定研究人員，獲國家優秀青年科學基金、“武漢英才”優秀青年人才等資助，任中國作物學會油料作物專業委員會委員。主要從事植物表觀/三維基因組學與油菜重要農藝性狀研究，以模式植物擬南芥和多倍體模式作物油菜等為對象，綜合運用遺傳學、分子生物學、基因組學、表觀/三維基因組學與生物信息學等手段，解析兩者在多倍體優勢及產量性狀形成中的遺傳與表觀遺傳調控機制。研究成果以第一或通訊作者（含共同）發表在Nature Plants (2篇)、Genome Biology (2篇)、Nature Communications (2篇)、Autophagy和Molecular Plant (2篇)等國際主流期刊，為解析油菜等作物重要農藝性狀調控機制及遺傳改良提供了新技術、新視角和新思路。具體研究方向如下：1）植物表觀/三維基因組學技術開發；2）植物表觀遺傳調控機制；3）油菜產量性狀調控機制；4）油菜多倍體雜種優勢形成機制。詳情請查看：

https://faculty.hzau.edu.cn/zhaolun/zh_CN/index.htm

Nature Plants論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41477-026-02258-z

《中國科學：生命科學》論文鏈接：

https://www.sciengine.com/SSV/doi/10.1360/SSV-2025-0259