全球每年約有500萬(wàn)人因交通事故、工傷、運(yùn)動(dòng)損傷等原因遭受周圍神經(jīng)損傷，不僅嚴(yán)重?fù)p害患者生活質(zhì)量，更帶來(lái)高達(dá)數(shù)百億美元的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。盡管電刺激已被證實(shí)能夠有效促進(jìn)神經(jīng)再生，但現(xiàn)有技術(shù)面臨能量供應(yīng)受限、長(zhǎng)期穩(wěn)定性差、需二次手術(shù)取出等臨床難題。近日，武漢理工大學(xué)戴紅蓮教授、伍小沛博士和武漢大學(xué)中南醫(yī)院喻愛喜教授合作，受電鰻放電機(jī)制啟發(fā)，他們成功開發(fā)出一種完全可降解的自供能水凝膠神經(jīng)導(dǎo)管，為周圍神經(jīng)修復(fù)提供了全新的解決方案。相關(guān)論文以“Eel-Inspired Self-Powered Hydrogel Nerve Conduit: A Fully Degradable Scaffold for Peripheral Nerve Repair”為題，發(fā)表在Advanced Materials上。

該研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為“電鰻仿生離子凝膠電池”的創(chuàng)新型水凝膠神經(jīng)導(dǎo)管。該材料以殼聚糖、硫酸軟骨素和羥乙基纖維素等天然多糖為原料，通過(guò)層層自組裝技術(shù)，模擬電鰻電器官的多層結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了機(jī)械性能與電導(dǎo)性能的協(xié)同優(yōu)化。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該導(dǎo)管能穩(wěn)定、持續(xù)地產(chǎn)生生物電信號(hào)；體內(nèi)大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型研究表明，植入該新型導(dǎo)管的實(shí)驗(yàn)組在神經(jīng)再生速度和功能恢復(fù)方面均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)神經(jīng)導(dǎo)管。組織學(xué)和電生理分析進(jìn)一步證實(shí)，該電池產(chǎn)生的微弱電流能有效激活施萬(wàn)細(xì)胞、引導(dǎo)軸突有序生長(zhǎng)并促進(jìn)髓鞘形成。

圖1 | 電鰻電器官的形態(tài)特征與功能機(jī)制及自供能神經(jīng)導(dǎo)管的構(gòu)建。 （A）電鰻的解剖結(jié)構(gòu)。（B）電細(xì)胞產(chǎn)生電壓的機(jī)制。（C）陰離子選擇性水凝膠和陽(yáng)離子選擇性水凝膠合成的分子式。（D）EE-iHB產(chǎn)生電壓的機(jī)制。當(dāng)水凝膠未接觸時(shí)，未檢測(cè)到電壓（上圖）；機(jī)械接觸（下圖）允許離子通過(guò)交替的離子選擇性膜，從而產(chǎn)生電勢(shì)。（E）EE-iHB的制備。（F）電刺激在神經(jīng)組織修復(fù)過(guò)程中激活的信號(hào)通路示意圖。

研究團(tuán)隊(duì)首先解決了傳統(tǒng)神經(jīng)導(dǎo)管材料疏水性強(qiáng)、生物相容性不足的問(wèn)題。他們將甲基丙烯酰化殼聚糖摻入聚己內(nèi)酯基質(zhì)中，通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備出高親水性薄膜。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)殼聚糖含量達(dá)到1%時(shí)，水接觸角從124.4度驟降至24.9度，親水性大幅提升，同時(shí)拉伸應(yīng)力和楊氏模量分別達(dá)到997.3 kPa和82.5 MPa，兼顧了優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度。掃描電鏡圖像顯示，殼聚糖的摻入并未改變聚己內(nèi)酯纖維的微觀形貌，纖維直徑穩(wěn)定在0.41至0.46微米之間。這些改良后的薄膜被卷繞在中空管上，構(gòu)成了神經(jīng)導(dǎo)管的主體結(jié)構(gòu)。

圖2 | PCL-CSMA電紡膜和水凝膠的制備與表征。 （A）靜電紡絲神經(jīng)導(dǎo)管制備示意圖。（B）不同CSMA摻雜比例的PCL電紡膜掃描電鏡圖像。（C）不同CSMA摻雜比例的PCL電紡膜水接觸角。（D）不同CSMA摻雜比例的PCL電紡膜纖維直徑統(tǒng)計(jì)分析。（E,F）不同CSMA摻雜比例PCL電紡膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線和拉伸模量（n=3）。（G,H）不同濃度QCS水凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線和壓縮模量（n=3）。（I,J）不同濃度HEC水凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線和壓縮模量（n=3）。（K-M）CS（K）、HEC（L）和CSA（M）改性前后的FTIR表征光譜。（N）水凝膠頻率掃描（0.01-100 rad/s，1%應(yīng)變）儲(chǔ)能模量（G'）曲線。（O）水凝膠旋轉(zhuǎn)應(yīng)變掃描（0.01-10000%應(yīng)變，10 rad/s）儲(chǔ)能模量（G'）曲線。（P）HEC-MA、QCS-MA和CSA-MA水凝膠轉(zhuǎn)化率與光交聯(lián)時(shí)間的關(guān)系（儲(chǔ)能模量G'和損耗模量G''）。p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001。

在仿生電池設(shè)計(jì)方面，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)五層異質(zhì)水凝膠結(jié)構(gòu)，依次為高鹽凝膠、陽(yáng)離子選擇膜、低鹽凝膠、陰離子選擇膜和高鹽凝膠，完美復(fù)刻了電鰻電器官的離子梯度放電機(jī)制。傅里葉變換紅外光譜和核磁共振氫譜驗(yàn)證了各層水凝膠材料的成功合成。流變學(xué)測(cè)試表明，所有光交聯(lián)水凝膠在紫外照射79秒后儲(chǔ)能模量均顯著超過(guò)損耗模量，形成了穩(wěn)定的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。壓縮循環(huán)測(cè)試顯示，經(jīng)過(guò)75次加載-卸載循環(huán)后，水凝膠仍能保留82.1%的原始?jí)嚎s模量，展現(xiàn)出優(yōu)異的抗疲勞性能。

電學(xué)性能測(cè)試是本研究的關(guān)鍵亮點(diǎn)。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，將4個(gè)凝膠單元串聯(lián)或并聯(lián)后，電壓和電流均實(shí)現(xiàn)4倍提升。在對(duì)比了鈉、鉀、鋅、鍶、鈣、鎂等多種鹽離子后，鎂離子因其低細(xì)胞毒性、高離子強(qiáng)度以及能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)被選為最佳電解質(zhì)。含有2摩爾每升鎂離子的凝膠電導(dǎo)率可達(dá)0.042西門子每米。在優(yōu)化的濃度梯度下，該離子凝膠電池可產(chǎn)生約150毫伏的穩(wěn)定電壓。更重要的是，該電池在60小時(shí)內(nèi)仍能保留51.2%的陽(yáng)離子和70.1%的陰離子，保證了持續(xù)的電輸出能力。外部壓力從0.5牛頓增加至10牛頓時(shí)，輸出電壓從172毫伏升至353毫伏，顯示出機(jī)械刺激對(duì)電性能的調(diào)控作用。

圖3 | EE-iHB的電輸出性能。 （A）不同連接方式下iHB的照片。（B）具有不同串聯(lián)和并聯(lián)連接的多單元EE-iHB的照片。（C）不同連接方式的EE-iHB的開路電壓和短路電流。（D）不同負(fù)載電阻下不同數(shù)量單元串聯(lián)或并聯(lián)時(shí)的歸一化電流和電壓。（E）不同鹽離子的EE-iHB開路電壓和短路電流。（F）含不同濃度MgCl2的HEC-MA水凝膠的奈奎斯特圖。（G）含不同濃度MgCl2的HEC-MA水凝膠的電導(dǎo)率。（H）不同濃度梯度下EE-iHB的開路電壓。（I）不同HEC-MA/CSA-MA比例下EE-iHB的開路電壓和短路電流。（J）不同QCS-MA濃度下EE-iHB的開路電壓和短路電流。（K）陽(yáng)離子選擇性和陰離子選擇性水凝膠的離子保留性能。（L,M）陽(yáng)離子選擇性和陰離子選擇性水凝膠中離子保留率隨時(shí)間的變化（n=3）。

生物相容性評(píng)估顯示，即使在高濃度鎂離子環(huán)境下，大鼠施萬(wàn)細(xì)胞存活率仍保持在74%以上，巨噬細(xì)胞未見明顯凋亡。劃痕實(shí)驗(yàn)表明，電刺激組在24小時(shí)內(nèi)的傷口愈合率達(dá)81.6%，顯著高于對(duì)照組。免疫熒光染色證實(shí)，電刺激使CD31和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的熒光強(qiáng)度分別上調(diào)3.0倍和2.6倍，展現(xiàn)出強(qiáng)大的促血管生成能力。同時(shí)，電刺激還顯著降低了巨噬細(xì)胞中CD86和腫瘤壞死因子α的表達(dá)，提示其具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示，電刺激組PI3K和Akt的磷酸化水平分別比對(duì)照組提高了2.25倍和1.57倍，激活了關(guān)鍵的促存活信號(hào)通路。

圖4 | 細(xì)胞遷移、成管及毒性實(shí)驗(yàn)。 （A）不同Mg2+濃度下RSCs的活/死染色。（B）電刺激對(duì)HUVECs在0至24小時(shí)內(nèi)遷移的影響。（C）不同支架共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中CD86和TNFα的免疫熒光染色。（D）VEGF/CD31的免疫熒光染色圖像。（E）不同Mg2+濃度下RSCs存活率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（n=3）。（F）12和24小時(shí)劃痕愈合率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。（G,H）術(shù)后24小時(shí)CD86、TNF-α免疫熒光結(jié)果（n=5）。（I,J）HUVECs培養(yǎng)24小時(shí)后CD31和VEGF的熒光染色圖像（n=5）。p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001。

圖5 | 電刺激促進(jìn)血管生成。 （A）PI3K/Akt信號(hào)通路示意圖。（B）PI3K和Akt蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。（C,D）p-PI3K和p-AKT的蛋白質(zhì)印跡灰度統(tǒng)計(jì)圖（n=3）。（E）使用8小時(shí)成管實(shí)驗(yàn)評(píng)估電刺激對(duì)HUVECs的促血管生成效果（n=4）。（F）HUVECs形成小管數(shù)量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（n=4）。（G）HUVECs小管分支節(jié)點(diǎn)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（n=5）。（H）術(shù)后1周近端神經(jīng)CD31和VEGF的免疫熒光染色。（I,J）CD31和VEGF的熒光染色統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（n=5）。p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析為電刺激的治療機(jī)制提供了分子層面的證據(jù)。主成分分析顯示電刺激組與對(duì)照組之間存在顯著的基因表達(dá)差異，共鑒定出1616個(gè)差異表達(dá)基因，其中874個(gè)上調(diào)、742個(gè)下調(diào)。基因本體論富集分析表明，這些差異基因與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞黏附和軸突生長(zhǎng)密切相關(guān)。京都基因與基因組百科全書富集分析顯示，電刺激顯著下調(diào)了NF-κB、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素-17等炎癥相關(guān)信號(hào)通路，同時(shí)上調(diào)了三羧酸循環(huán)通路，提示電刺激可能通過(guò)調(diào)控代謝狀態(tài)促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。基因集富集分析進(jìn)一步證實(shí)，鈣信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合和AMPK信號(hào)通路在電刺激組中顯著上調(diào)。

圖6 | ES對(duì)炎癥、纖維化和再生的調(diào)控。 （A）差異表達(dá)基因火山圖。（B）GO富集條形圖（細(xì)胞黏附、炎癥和神經(jīng)生長(zhǎng)）。（C）KEGG通路基因集富集分析。（D）GO基因集富集分析。（E）KEGG富集散點(diǎn)圖（細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥和神經(jīng)再生）。（F）熱圖顯示與空白對(duì)照組相比，選定炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平的相對(duì)變化。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果是驗(yàn)證該導(dǎo)管療效的關(guān)鍵。術(shù)后4周的組織學(xué)分析顯示，電刺激組中NF200和S100的熒光強(qiáng)度均顯著高于對(duì)照組和水凝膠組，僅次于自體神經(jīng)移植組——后者被視為神經(jīng)修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Ki67細(xì)胞增殖標(biāo)記物的檢測(cè)結(jié)果表明，電刺激組的細(xì)胞增殖活性同樣僅次于自體移植組，證實(shí)電刺激促進(jìn)了施萬(wàn)細(xì)胞等神經(jīng)相關(guān)細(xì)胞的增殖。術(shù)后12周，甲苯胺藍(lán)和固藍(lán)染色定量分析顯示，電刺激組的施萬(wàn)細(xì)胞密度和髓鞘陽(yáng)性面積均顯著優(yōu)于對(duì)照組。透射電鏡圖像進(jìn)一步證實(shí)，電刺激組的髓鞘密度、髓鞘厚度和軸突直徑均僅次于自體移植組。電生理檢測(cè)顯示，電刺激組的復(fù)合肌肉動(dòng)作電位振幅為50.61毫伏，神經(jīng)傳導(dǎo)速度為52.8米每秒，分別達(dá)到自體移植組的76.4%和84.8%。坐骨神經(jīng)功能指數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示，電刺激組為-62.34，顯著優(yōu)于對(duì)照組的更低數(shù)值。腓腸肌濕重比和肌纖維形態(tài)分析也證實(shí)電刺激有效減輕了失神經(jīng)性肌萎縮。安全性評(píng)估表明，術(shù)后12周各主要臟器未見明顯損傷，組織中的鎂離子濃度維持在正常生理范圍內(nèi)，殼聚糖寡糖幾乎檢測(cè)不到，證實(shí)了該材料的長(zhǎng)期生物安全性。

圖7 | 體內(nèi)坐骨神經(jīng)再生評(píng)估。 （A）植入裝置的照片。（B）術(shù)后4周神經(jīng)組織DAPI、NF200、S100和Merge的免疫熒光染色。（C）術(shù)后1周近端神經(jīng)Ki67的免疫熒光染色。（D,E）NF200和S100熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（n=4）。（F）術(shù)后1周Ki67熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（n=5）。p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001。

圖8 | 電刺激改善軸突形態(tài)并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。 （A）術(shù)后12周坐骨神經(jīng)HE、LFB和TB染色。（B）再生軸突的透射電鏡圖像。（C）大鼠足跡采集與測(cè)量示意圖。（D）大鼠足跡典型圖像（健側(cè)：紅色；患側(cè)：藍(lán)色）。（E）大鼠電生理曲線。（F,G）術(shù)后12周大鼠腓腸肌對(duì)比圖像（左：健側(cè)；右：患側(cè)）及患側(cè)Masson三色染色。比例尺：200 μm。（H）LFB染色圖像中髓鞘陽(yáng)性面積百分比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（n=4）。（I）TB染色圖像中施萬(wàn)細(xì)胞陽(yáng)性面積百分比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（n=5）。（J）12周時(shí)SFI值（n=5）。（K）腓腸肌濕重比（患側(cè)/健側(cè)）統(tǒng)計(jì)結(jié)果。（L）再生神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（n=5）。p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001。

圖9 | 電刺激改善軸突形態(tài)并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

總結(jié)而言，這項(xiàng)受電鰻啟發(fā)的完全可降解離子凝膠電池，通過(guò)持續(xù)電刺激、抗炎調(diào)控和促血管生成的協(xié)同作用，為周圍神經(jīng)修復(fù)提供了創(chuàng)新性解決方案。與傳統(tǒng)材料相比，該水凝膠的放電持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)了3至5倍，術(shù)后12周神經(jīng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)率達(dá)79.6%，顯著高于對(duì)照組的46.4%。研究者指出，該材料在大型動(dòng)物模型中的長(zhǎng)期生物安全性、針對(duì)不同損傷類型的個(gè)性化優(yōu)化以及外部電路控制系統(tǒng)開發(fā)等方面仍有待進(jìn)一步探索。該研究建立的多功能設(shè)計(jì)范式為開發(fā)下一代神經(jīng)再生療法開辟了新的可能。