1 實驗目的

小鼠明暗箱實驗是經典的動物行為學實驗，主要用于評價小鼠的自發活動能力及焦慮樣行為。本實驗利用小鼠趨暗避明的先天習性與探索新環境的本能沖突，通過檢測小鼠在明箱、暗箱中的活動時長、穿梭次數等核心指標，量化評估小鼠焦慮情緒水平，可廣泛應用于抗焦慮藥物藥效篩選、神經精神疾病模型驗證、情緒調控機制研究等相關科研工作。

2 實驗原理

嚙齒類動物小鼠具有天然的趨暗、避光習性，黑暗環境可使其產生安全感，而明亮、開闊的環境會誘發小鼠產生緊張、焦慮情緒。同時，小鼠具備探索陌生環境的本能，會主動對新異環境進行探究。明暗箱裝置由互通的明箱（光亮開闊）和暗箱（黑暗封閉）組成，實驗過程中小鼠可自由在兩箱間穿梭。

正常小鼠會表現出偏好暗箱、極少停留明箱的行為特征；當小鼠處于焦慮緩解狀態或接受抗焦慮藥物干預后，其對明亮環境的恐懼降低，會顯著增加明箱停留時長、提升跨箱探索次數；而焦慮程度加重的小鼠則會極度規避明箱，幾乎全程停留于暗箱。通過行為學視頻分析系統記錄并統計相關行為學指標，即可客觀量化小鼠焦慮樣行為程度。

3 實驗材料與儀器
3.1 實驗動物

選用健康SPF級小鼠，常用品系為C57BL/6J、ICR或KM小鼠，年齡6~8周，體重20~24g，雌雄可根據實驗需求選擇（實驗需統一性別，避免性別差異干擾結果）。小鼠飼養于標準動物飼養環境，溫度22~25℃，濕度50%~60%，12h光照/12h黑暗晝夜循環，自由攝食飲水，適應性飼養3d后開展實驗，實驗前禁食不禁水12h。

3.2 實驗儀器

明暗箱行為學檢測裝置，整體為密閉避光箱體，分為大小均等的明箱和暗箱兩部分。明箱配備LED均勻光源，光照強度可調（標準檢測強度300~500lx），箱體內壁為白色；暗箱完全遮光，內壁為黑色，無任何光源。兩箱中間設有規格統一的方形穿梭洞口（寬5cm×高5cm），可供小鼠自由穿梭。配套高清紅外攝像系統、動物行為學智能分析軟件、計時器、75%醫用酒精、無塵吸水紙。

3.3 實驗環境

實驗在安靜、隔音、避光的獨立行為學實驗室進行，環境溫度23~26℃，濕度55%±5%，實驗過程中無人員走動、噪音干擾，保證實驗環境穩定一致。

4 實驗操作步驟
4.1 實驗前準備

實驗開始前30min，將待檢測小鼠轉移至行為學實驗室，使其適應實驗環境溫度、光線及噪音環境，消除運輸應激對實驗結果的影響。同時調試明暗箱設備，校準明箱光照強度至400lx，檢查穿梭洞口通暢性，開啟攝像系統與行為分析軟件，設置實驗記錄參數。隨后用75%酒精徹底擦拭明箱、暗箱內壁及底部，去除殘留的小鼠氣味、排泄物，待酒精完全揮發后備用，避免氣味殘留干擾小鼠行為。

4.2 正式實驗

1. 將小鼠輕柔取出，背對穿梭洞口，平穩放置于明暗箱明箱中央位置，立即關閉實驗室房門，啟動計時器與視頻錄制，開始正式實驗，單次實驗時長設置為5min（經典檢測時長，可根據實驗方案調整為10min）。

2. 實驗過程中，小鼠可自由在明箱、暗箱之間穿梭、探索、停留，全程禁止人員靠近設備、注視小鼠或產生任何聲響干擾，保證小鼠自主完成行為活動。

3. 實驗計時結束后，立即取出小鼠，放回原飼養籠。隨即再次用75%酒精擦拭明暗箱所有區域，清除小鼠排泄物、毛發，待酒精揮發后，進行下一只小鼠的檢測，所有小鼠實驗順序隨機，避免時間梯度誤差。

4.3 實驗后處理

全部小鼠檢測完畢后，關閉儀器設備，整理實驗場地，清潔消毒實驗裝置。根據動物倫理規范處置實驗小鼠，妥善保存實驗視頻數據，備份行為學分析文件。

5 數據采集與處理
5.1 核心檢測指標

通過行為學智能分析軟件自動識別并統計以下關鍵指標，輔以人工復核校準：

（1）明箱停留總時長：小鼠在明箱內停留的累計時間；

（2）暗箱停留總時長：小鼠在暗箱內停留的累計時間；

（3）穿梭總次數：小鼠通過中間洞口往返明暗兩箱的總次數，反映小鼠探索活性；

（4）明箱活動路程、明箱直立探索次數：輔助評價小鼠自主活動與探索行為。

5.2 數據統計分析

采用SPSS、GraphPad Prism等統計軟件進行數據分析，所有計量數據以“平均值±標準差”表示。多組間數據比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD或Duncan檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。明箱停留時長占比=明箱停留總時長/實驗總時長×100%，該比值為評價焦慮水平的核心指標，比值越高，表明小鼠焦慮程度越低。

6 實驗注意事項

1. 應激控制：小鼠對應激刺激高度敏感，抓取小鼠時動作需輕柔，禁止暴力拖拽、擠壓，實驗全程保持環境安靜，噪音、強光、人員干擾均會導致小鼠焦慮異常，造成實驗數據偏差。

2. 環境一致性：全程固定光照強度、環境溫度、濕度，所有組別小鼠實驗時間統一，避免晝夜節律、環境參數波動影響小鼠行為。

3. 氣味消除：每只小鼠實驗后必須徹底消毒箱體，小鼠氣味殘留會對后續小鼠產生氣味提示，改變其探索行為，是實驗誤差的主要來源之一。

4. 數據有效性判定：若小鼠實驗全程靜止、蜷縮不動或持續攀爬箱體、反復刻板行為，判定為無效數據，需剔除并補做實驗。

5. 操作標準化：所有實驗操作由同一人員完成，統一抓取方式、放置位置，避免人為操作差異干擾實驗結果。

7 實驗重復性與質量控制

實驗前對設備進行定期校準，保證光照強度、箱體尺寸參數恒定；實驗采用隨機分組、平行對照設計，設置空白對照組與模型對照組，排除實驗系統誤差；單次實驗樣本量不少于6只，保證數據統計學效力；所有實驗流程嚴格標準化，詳細記錄實驗時間、環境參數、操作細節，保障實驗可重復。

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