2026年4月15日，加拿大圭爾夫大學Georgina Cox團隊，聯合加拿大西安大略大學David E. Heinrichs團隊、美國堪薩斯大學醫學中心Jeffrey L. Bose團隊、比利時魯汶大學Yves F. Dufrêne團隊等，在Nature Communications（中科院1區，2024 Impact Factor=15.7）在線發表題為“An anti-adhesive compound modulating the production of Staphylococcus aureus cell wall-anchored proteins”的研究論文。該文于2025年3月14日投稿，2026年4月2日接收，2026年4月15日在線發表。

金黃色葡萄球菌，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），是抗菌藥物耐藥相關感染中的重要病原。其能夠定植于鼻腔和角化皮膚，并通過細胞壁錨定蛋白與宿主角蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原等配體結合，從而促進定植、侵襲和感染進展。傳統抗菌策略多以殺滅或抑制細菌生長為目標，但這種方式容易帶來耐藥壓力，因此“抗黏附”和“抗毒力”策略逐漸受到關注。

本研究通過高通量全細胞篩選，從3921種生物活性化合物中鑒定出天然多不飽和支鏈脂肪酸香葉基香葉酸（geranylgeranoic acid，GGA）。研究發現，GGA在較高濃度下具有殺菌作用，而在亞殺菌劑量下可顯著抑制MRSA對角蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原和免疫球蛋白的黏附。進一步機制研究顯示，GGA可調控金黃色葡萄球菌細胞壁錨定蛋白（CWA proteins）的產生，其中對纖連蛋白結合蛋白的影響主要通過抑制SaeRS雙組分系統實現，并進一步下調多種毒力因子。同時，研究還提示GGA可能作用于SaeRS之外的其他轉錄調控因子。

值得關注的是，GGA不僅對多株多重耐藥金黃色葡萄球菌臨床分離株表現出抗黏附活性，還在小鼠MRSA皮膚和軟組織感染模型中顯示出一定保護作用，可降低皮膚壞死性病灶嚴重程度并影響細菌負荷。該研究為MRSA感染干預提供了不同于傳統抗生素的新思路，即通過削弱細菌黏附和毒力表達，降低其致病能力。不過，目前這些結果仍主要來自體外實驗和動物模型，GGA是否能夠進一步發展為臨床抗MRSA候選物，還需要更多體內療效、安全性、給藥方式以及耐藥風險評估研究支持。

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【摘要】

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是與抗菌藥物耐藥相關死亡的重要全球病原之一。該菌常定植于人鼻腔，并可黏附于角化皮膚，形成后續感染的“儲存庫”，因此亟需新的去定植策略。

本研究利用高通量全細胞篩選平臺，鑒定出香葉基香葉酸（geranylgeranoic acid，GGA）這一天然存在的多不飽和支鏈脂肪酸，并發現其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）具有雙重活性。在較高濃度下，GGA表現出殺菌作用；而在亞殺菌劑量下，GGA能夠有效抑制MRSA對角蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原和免疫球蛋白的黏附。

GGA還可抑制多株多重耐藥金黃色葡萄球菌臨床分離株的黏附，并在小鼠MRSA皮膚和軟組織感染模型中顯示出作用效果，為應對這一難治病原體提供了新的研究方向。機制上，GGA的抗黏附活性與其調控金黃色葡萄球菌細胞壁錨定蛋白（cell wall-anchored proteins，CWA proteins）的轉錄有關。對于纖連蛋白結合蛋白而言，這一作用由GGA抑制SaeRS雙組分系統所介導，進而下調多種金黃色葡萄球菌毒力因子。研究數據還提示，除SaeRS外，GGA可能還作用于其他轉錄調控因子。這些發現拓展了GGA研究的轉化意義，也提示其具有作為抗MRSA治療候選物的潛力。

01

研究背景及科學問題

金黃色葡萄球菌是全球范圍內與抗菌藥物耐藥相關死亡的重要病原體。它既可引起社區感染，也可引起醫院感染，其致病基礎之一在于能夠定植于人體皮膚和鼻腔。超過80%的成人會出現間歇性定植，約20%的人會在前鼻腔持續定植金黃色葡萄球菌。

金黃色葡萄球菌能夠定植鼻黏膜上皮，與其產生細胞壁錨定黏附蛋白密切相關。例如凝集因子B（clumping factor B，ClfB）可強烈結合表皮中的角化包膜蛋白，包括角蛋白和兜甲蛋白，從而幫助細菌逃避宿主防御機制的清除。定植之后，其他細胞壁錨定蛋白以及多種毒力因子還會通過與宿主配體相互作用，推動感染建立和疾病進展。多數金黃色葡萄球菌感染來源于這些定植菌株，這說明宿主黏附過程在感染發生中具有關鍵作用，也提示靶向黏附過程可能成為治療干預的新方向。

目前，術前使用莫匹羅星進行鼻腔去定植是一種常規做法，但耐藥問題正在增加，部分報道中的耐藥率可高達80%。因此，臨床上迫切需要新的替代性去定植策略，尤其是那些不直接作用于細菌必需生長通路、從而可能減少耐藥進化壓力的策略。

抗黏附藥物有望回應這一臨床需求，但目前針對金黃色葡萄球菌的抗黏附抑制劑仍然有限，也尚無獲批用于臨床的相關藥物。發現此類抑制劑的難點之一，在于可用于化合物篩選的高通量全細胞檢測體系較少。傳統方法常常聚焦于特定靶點，例如負責將黏附蛋白共價錨定到細胞壁上的管家型轉肽酶Sortase A，這會限制可發現抑制劑的類型。相比之下，全細胞檢測體系可以進行無偏倚的表型篩選，覆蓋更廣泛的潛在靶點空間，并有機會發現作用機制不同的化合物。更重要的是，基于細胞的檢測可以保證篩選化合物具有真實的生物學活性，而這正是靶點導向藥物發現中常見的限制因素。

為突破這一瓶頸，研究團隊此前建立了一種基于ELISA的高通量全細胞檢測方法，用于檢測金黃色葡萄球菌對宿主配體的黏附。本研究利用該體系篩選抗黏附化合物，鑒定出香葉基香葉酸（GGA）可抑制調控CWA黏附蛋白和其他金黃色葡萄球菌毒力因子產生的轉錄調控系統。GGA可破壞金黃色葡萄球菌對角蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原和免疫球蛋白等關鍵宿主配體的黏附，并對臨床分離株表現出抗黏附活性。在小鼠皮膚感染模型中的效果進一步提示，GGA可能具有抗MRSA應用前景。研究結果也進一步強調，不飽和脂肪酸在先天免疫反應中具有多層次作用。

02

重要發現及亮點

GGA被鑒定為抑制金黃色葡萄球菌黏附角蛋白的候選化合物

考慮到金黃色葡萄球菌對角蛋白的黏附在宿主定植和感染中具有關鍵作用，研究團隊將既有的ELISA法MRSA黏附檢測體系改造為高通量化合物篩選平臺。研究者使用來源于USA300克隆的社區獲得性MRSA菌株JE2，對3921種生物活性化合物進行篩選。該化合物庫包括FDA批準藥物、純化天然產物以及結構多樣、具有類藥性質的分子。

實驗中，JE2在每種化合物存在下培養至OD600nm為0.6，這一階段代表其角蛋白黏附能力較強。隨后將處理后的細菌加入包被角蛋白的微孔板中檢測黏附。研究者計算每種化合物處理后黏附水平與生長水平之間的比值，并通過四分位均值進行標準化。篩選標準設定為：在10 μM濃度下，化合物對細菌生長的抑制不超過25%，但可使黏附降低至少30%。根據這一標準，篩選命中率為0.3%，并提示兩親性化合物出現富集。

在進一步驗證抗黏附活性、效力和重復性后，研究團隊將GGA確定為先導化合物。GGA是一種天然存在的二萜類化合物，結構上類似存在于藥用植物中的多不飽和支鏈脂肪酸，也是香葉基香葉基焦磷酸的前體，而后者是異戊二烯類物質生物合成中的重要中間產物。既往研究顯示，GGA具有癌癥預防相關活性，并對沙門氏菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌等多種細菌表現出中等至較弱的抗菌活性。

隨后，研究者重新購入GGA，并通過基于ELISA的黏附實驗進行劑量依賴性分析。結果證實，GGA可在不明顯抑制生長的濃度下抑制金黃色葡萄球菌對角蛋白的黏附。掃描電子顯微鏡觀察顯示，與未處理對照相比，GGA并未影響金黃色葡萄球菌的細胞形態。研究者還使用結晶紫作為替代檢測方法，進一步確認了GGA的抗黏附作用。與此同時，GGA的抗黏附活性具有pH依賴性，在pH 7–9范圍內作用更強。

實驗中還設置了黏附缺陷型轉座子突變株srtA::Tn作為對照。該菌株缺乏管家型分選酶Sortase A（SrtA），而SrtA負責將金黃色葡萄球菌黏附蛋白共價錨定至肽聚糖。GGA處理可將黏附水平抑制到接近srtA::Tn突變株的程度，說明其具有較強的抗黏附活性。由于GGA活性與pH相關，后續機制實驗均在pH 7.0緩沖培養基中進行，這一條件對應GGA較佳活性。

圖1：鑒定香葉基香葉酸（GGA）為抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）黏附人角蛋白的化合物。（A）高通量化合物篩選的工作流程。（B）對生物活性化合物庫（n=3921）在MRSA USA300菌株JE2（JE2）中的大規模篩選。命中化合物定義為：可使黏附降低≥30%（Abs450nm），且不影響生長或生長抑制≤25%（OD600nm）。命中化合物用橙色方框標出。（C）每種化合物存在下角蛋白黏附水平（Abs450nm）的重復實驗圖；（D）每種化合物存在下細菌生長水平（OD600nm）的重復實驗圖。R1表示生物學重復1，R2表示生物學重復2。（E）GGA處理JE2細胞后的劑量滴定黏附實驗（藍色圓點，Abs450nm）和生長抑制分析（橙色圓點，OD600nm）。圖中顯示GGA的化學結構及黏附半數抑制濃度（平均Adhesion IC50 ± 標準誤，n=3個生物學重復）。每個橙色數據點代表n=3個生物學重復的平均生長水平，誤差線表示標準差（SD）。（F）JE2細胞在0.05%乙醇條件下，加入或不加入GGA（10 μM，溶于0.05%乙醇）后的掃描電子顯微鏡分析。更多生物學重復結果（共n=3個生物學重復）見圖S1。

GGA的結構活性關系顯示羧酸基團和不飽和程度十分關鍵

為了明確GGA抗黏附活性所依賴的化學結構特征，研究團隊開展了結構活性關系（structure-activity relationship，SAR）研究。首先，研究者對初篩中所用生物活性化合物庫進行計算機分析，發現羧酸結構片段對GGA活性非常重要。三種與GGA類似、同樣具有多不飽和和支鏈特征的醇類化合物，包括GGA的醇衍生物geranylgeraniol，在初篩中并未表現出活性，因此在該階段即被排除。

為進一步探究其他脂肪酸是否也能抑制金黃色葡萄球菌對角蛋白的黏附，研究者選擇了一組鏈長和飽和程度不同的脂肪酸進行比較。首先，研究者評估這些脂肪酸的生長抑制作用，發現其對細菌生長的影響程度不同。隨后在10 μM濃度下檢測每種脂肪酸的抗黏附活性，該濃度低于生長抑制水平。

總體來看，飽和脂肪酸未表現出抗黏附活性；而所有順式不飽和脂肪酸以及兩種反式不飽和脂肪酸均能抑制角蛋白黏附。順式不飽和脂肪酸的抗黏附效力強于反式不飽和脂肪酸。尤其是具有彎曲碳鏈結構的順式脂肪酸，其抗黏附活性可接近GGA和黏附缺陷型srtA::Tn突變株。

對于初始實驗中未表現出抗黏附活性的脂肪酸，研究者在不明顯影響細菌生長、并保證溶解性的前提下提高濃度繼續檢測。肉豆蔻酸（C14:0）在100 μM時顯示出較弱抗黏附活性，而肉豆蔻反油酸（trans-C14:1）在50 μM時表現出與GGA相近的效力。其余脂肪酸即使在較高濃度下仍未表現出抗黏附活性。

這些結果說明，順式雙鍵的存在對抗黏附活性至關重要，而鏈長似乎不是決定性因素。若雙鍵為反式構型，鏈長增加與抗黏附活性增強有關，但總體效力仍較低。因此，羧酸基團和不飽和程度是決定GGA活性的關鍵因素。值得注意的是，雖然脂肪酸已知可以阻礙生物膜形成，但本研究首次報道脂肪酸還能抑制金黃色葡萄球菌對宿主配體的黏附。

圖2：GGA的結構活性關系研究。研究通過評估10 μM飽和脂肪酸、順式不飽和脂肪酸和反式不飽和脂肪酸處理后，MRSA USA300 JE2（JE2）對0.5 μg/孔角蛋白的黏附抑制情況（Abs450nm），分析結構活性關系。GGA（10 μM，藍色方塊）作為比較對象。灰色方框中顯示每種脂肪酸的化學結構。每種脂肪酸處理后的JE2黏附水平在獨立實驗中檢測，每個實驗n=3個生物學重復。每個數據點對應一個生物學重復，圖中顯示均值和標準差（SD）。脂肪酸處理樣本均以每個獨立實驗中的未處理對照（JE2）進行標準化，橙色線表示未處理對照。每次分析脂肪酸時，均納入未處理的JE2-srtA::Tn突變株作為黏附缺陷對照。脂肪酸處理樣本和JE2-srtA::Tn突變株均與JE2（100%）比較，并采用雙尾單樣本t檢驗。與未處理對照（JE2）相比，黏附顯著降低標記為P ≤ 0.01**和P ≤ 0.0001****。相關結果見圖S3和圖S4。SCFA：直鏈脂肪酸；BCFA：支鏈脂肪酸。精確P值（相對于JE2）：C14:0，P=0.780；C14:1，P=0.684；C16:0，P=0.242；C16:1，P=0.005；C18，P=0.063；C18:1（順式），P=1.9E-05；C18:1（反式），P=0.002；C18:2（順式），P=8.9E-05；C18:2（反式），P=0.001；C18:3，P=1.9E-07；C20，P=0.800；C20:4，P=9.7E-05；GGA，P=3.6E-05；srtA::Tn，P≤0.0001。

GGA廣泛抑制黏附，并調控金黃色葡萄球菌細胞壁錨定蛋白

為進一步解析GGA的作用機制，研究團隊考察其抗黏附作用是否僅限于角蛋白，還是也適用于其他宿主配體。結果顯示，GGA處理顯著降低金黃色葡萄球菌與多種宿主配體的結合，包括纖連蛋白和纖維蛋白原。纖連蛋白結合可幫助金黃色葡萄球菌與內皮細胞相互作用，并觸發肌動蛋白重塑和細胞侵襲。

為了驗證這一發現的生物學相關性，研究者進一步檢測GGA處理對金黃色葡萄球菌黏附永生化人微血管內皮細胞系HMEC-1的影響。結果顯示，GGA顯著降低細菌對HMEC-1細胞的黏附。這說明GGA不僅削弱對角蛋白的黏附，也能廣泛抑制金黃色葡萄球菌與宿主成分的黏附。

基于這些結果，研究團隊提出假設：GGA可能調節細胞壁錨定蛋白的豐度或表面定位。這類表面蛋白介導金黃色葡萄球菌與多種宿主配體結合，并通過管家型轉肽酶Sortase A共價連接到肽聚糖上。GGA將黏附降低到接近srtA::Tn突變株水平，也進一步支持其可能影響CWA蛋白。

研究者隨后采用基于ELISA的全細胞方法，檢測不同類別、結構多樣的CWA蛋白在細菌表面的豐度。金黃色葡萄球菌主要的角蛋白黏附蛋白是ClfB，但由于商業化抗ClfB抗體會與其他表面蛋白交叉反應，定制的單特異性抗體也無法可靠檢測表面ClfB，因此研究者未能直接測定ClfB表面豐度。

由于GGA可降低金黃色葡萄球菌與纖連蛋白結合，且研究團隊擁有針對CWA纖連蛋白結合蛋白（fibronectin-binding proteins，FnBPs）的抗體，因此重點檢測了FnBPs的表面豐度。同時，為判斷GGA是否廣泛影響CWA蛋白，研究者還檢測了另外兩種CWA蛋白：金黃色葡萄球菌免疫球蛋白結合蛋白A（SpA）和鐵調控表面決定因子A（IsdA）。SpA有助于免疫逃逸；IsdA可結合宿主血紅蛋白和三價鐵-血紅素，促進宿主體內鐵獲取。

檢測結果顯示，與未處理對照相比，GGA顯著降低FnBPs、SpA和IsdA三種CWA蛋白在細菌表面的豐度。為了進一步驗證，研究團隊使用纖連蛋白功能化的原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）探針，通過單分子力譜（single-molecule force spectroscopy，SMFS）直接檢測活細胞表面FnBPs介導的纖連蛋白黏附。未處理細胞表現出典型的FnBP介導黏附；而缺失FnBPs的突變株幾乎完全喪失黏附，證明該檢測確實反映FnBP介導的相互作用。GGA和亞油酸處理后的細胞與纖連蛋白的相互作用顯著減少，黏附力接近FnBPs缺失細胞。

SMFS還可繪制細胞表面蛋白分布的空間圖譜，結果顯示存在黏附納米結構域，研究者認為這可能反映蛋白在細胞表面聚集，而細菌正可通過這種機制增強黏附。最后，為判斷GGA是降低CWA蛋白總體細胞豐度，還是僅影響其表面展示，研究者通過免疫印跡檢測全細胞裂解液中的FnBPs和SpA。結果顯示，GGA降低了這兩類蛋白在細胞總體水平上的豐度。

圖3：GGA是一種廣譜抗黏附化合物，可調控金黃色葡萄球菌細胞壁錨定（CWA）蛋白。（A）10 μM GGA處理后，MRSA USA300 JE2（JE2）對纖連蛋白和纖維蛋白原的黏附（Abs450nm）降低。相關結果見圖S5A、B。數據點表示n=3個生物學重復的均值 ± SD。JE2-srtA::Tn突變株作為黏附缺陷陰性對照。纖連蛋白黏附的精確P值：JE2+GGA（相對于JE2），P=1.4E-05；JE2-srtA::Tn（相對于JE2），P=9.3E-06。纖維蛋白原黏附的精確P值：JE2+GGA（相對于JE2），P=6.0E-05；JE2-srtA::Tn（相對于JE2），P=4.5E-06。（B）GGA（10 μM）處理對JE2黏附HMEC-1內皮細胞的影響。每個數據點代表一個細菌生物學重復及均值SD（n=9個生物學重復）。差異采用Brown-Forsythe和Welch ANOVA分析，并使用Dunnett’s T3多重比較檢驗，將每個實驗組與未處理對照（JE2）比較。P ≤ 0.01**，P ≤ 0.0001****。（C）GGA處理（10 μM）降低固定化全JE2細胞表面的纖連蛋白結合蛋白（FnBPAB）、SpA和IsdA豐度（圖S5C）。每個數據點代表一個生物學重復（n=3個生物學重復），誤差線表示均值的SD。對于（A）和（C），組間差異采用單因素ANOVA分析，并使用Dunnett多重比較檢驗，將每個實驗組與未處理對照（JE2）比較。P ≤ 0.001***，P ≤ 0.0001****。（D）箱線圖顯示使用基于AFM的單分子力譜檢測JE2（綠色）和JE2-?fnbAB（橙色）細胞在GGA和亞油酸（linoleic acid，LA）（10 μM）處理后的纖連蛋白黏附概率，圖中顯示實驗裝置。每種條件分別檢測n=6、6、7、9、7和6個細胞。相關結果見圖S6、S7。星號表示均值，線表示中位數，箱體表示25%–75%四分位數，須表示SD。P值采用單因素Brown-Forsythe和Welch ANOVA檢驗，并結合Dunnett T3多重比較檢驗計算。P<0.05*，P ≤ 0.01**。精確P值：JE2-?fnbAB（相對于JE2），P=0.011；JE2+LA（相對于JE2），P=0.0095；JE2+GGA（相對于JE2），P=0.008。（E）使用免疫印跡檢測JE2全細胞裂解液中的FnBPs和SpA，并采用stain-free方法以總蛋白進行標準化（圖S5D）。FnBPs以FnBPA和FnBPB的累積強度表示。蛋白水平相對于未處理對照（JE2）表達。圖中顯示一個重復實驗的代表性免疫印跡。數據表示為n=3個生物學重復的均值 ± SD。每個實驗組與JE2（設為100%）比較的統計顯著性采用單樣本t檢驗，并進行Bonferroni多重比較校正。P ≤ 0.01**。FnBPs免疫印跡的精確P值：JE2+GGA（相對于JE2），P=0.0048；JE2-saeS::Tn（相對于JE2），P=0.0048。SpA免疫印跡的精確P值：JE2+GGA（相對于JE2），P=0.0054；JE2-saeS::Tn（相對于JE2），P=0.1562。

GGA的抗黏附作用不依賴蛋白酶產生，也不依賴膜磷脂摻入

CWA表面蛋白的細胞豐度可能受到蛋白酶介導的翻譯后降解影響。研究者最初假設，GGA可能激活金黃色葡萄球菌蛋白水解級聯反應（Staphylococcal Proteolytic Cascade，SPC），該級聯包括aureolysin、SspA和SspB。這些蛋白酶可切割細菌和宿主蛋白，包括多種CWA蛋白，從而影響其穩定性并可能降低黏附。

為驗證這一點，研究者通過分析甘油酯水解酶Geh的豐度，考察GGA對蛋白酶產生的影響。Geh是一種可被蛋白酶水解的分泌性脂肪酶。亞油酸等脂肪酸可誘導SPC，使72 kDa Geh前體（pro-Geh）被切割為成熟的40 kDa Geh，該過程可通過分泌蛋白SDS-PAGE檢測。與未處理對照相比，GGA和陽性對照亞油酸均增加MRSA USA300 AH1263細胞中pro-Geh的切割。蛋白酶缺失突變株KB4058不能將pro-Geh加工為成熟形式，因此作為陰性對照。盡管GGA確實增加了蛋白酶產生，但它同樣能夠抑制蛋白酶缺失KB4058突變株的黏附，說明GGA的抗黏附機制并不依賴蛋白酶誘導。

另一方面，金黃色葡萄球菌可通過脂肪酸激酶（fatty acid kinase，Fak）復合體攝取外源不飽和脂肪酸，用以補充內源性脂肪酸生物合成。由于本研究中其他脂肪酸可經Fak摻入膜磷脂，研究團隊進一步判斷GGA是否也會以類似方式進入細菌膜。結果顯示，Fak復合體對GGA無激酶活性，而對已知Fak底物油酸具有明顯活性。隨后研究者提取GGA處理細胞中的磷脂，并采用液相色譜-串聯質譜分析。由于溶血磷脂酰甘油和心磷脂來源于磷脂酰甘油，而后者是金黃色葡萄球菌膜中最豐富的磷脂，因此分析重點放在磷脂酰甘油上。脂質譜結果顯示，GGA處理細胞與對照之間無顯著差異，也未檢測到不飽和脂肪酸種類的出現。

圖4：GGA的抗黏附活性與蛋白酶產生或膜磷脂摻入無關。（A）脂肪酸處理后，MRSA USA300菌株AH1263中總pro-Geh（未切割Geh）的定量。每個數據點代表一個生物學重復（總計n=3個生物學重復），誤差線表示均值的SD。組間差異采用單因素ANOVA分析，并使用Dunnett多重比較檢驗，將每個實驗組與野生型對照（AH1263）比較，P ≤ 0.01**。精確P值：AH1263+LA（相對于AH1263），P=0.0065；AH1263+GGA（相對于AH1263），P=0.0067；KB4058（相對于AH1263），P=0.8772。相關結果見圖S8。（B）采用ELISA法檢測AH1263加入或不加入10 μM GGA時的角蛋白黏附，并與蛋白酶缺失菌株KB4058加入或不加入10 μM GGA進行比較。每個數據點代表n=3個生物學重復的均值，誤差線表示均值的SD。P值采用雙尾非配對Student’s t檢驗計算。與野生型AH1263或蛋白酶缺失KB4058相比，GGA處理后表面豐度顯著降低分別標記為P<0.05*和P ≤ 0.01**。精確P值：AH1263+GGA（相對于AH1263），0.5 μg/孔：P=0.012，0.25 μg/孔：P=0.009，0.125 μg/孔：P=0.007，0.0625 μg/孔：P=0.023。精確P值：KB4058+GGA（相對于KB4058），0.5 μg/孔：P=0.004，0.25 μg/孔：P=0.007，0.125 μg/孔：P=0.003，0.0625 μg/孔：P=0.014。（C）在5 mM油酸（oleic acid，OA，陽性對照）、5 mM GGA和無脂肪酸條件下進行脂肪酸激酶（Fak）復合體體外活性實驗。柱狀圖表示均值（n=3次酶反應），誤差線表示SEM。顯示的數據來自一個代表性實驗。**P<0.01，采用單因素ANOVA并結合Dunnett多重比較檢驗，將每個實驗組與陽性對照OA比較。精確P值：OA（相對于GGA），P=0.0020；OA（相對于無脂肪酸），P=0.0018。（D）JE2加入或不加入10 μM GGA后的磷脂酰甘油脂質譜。數據表示為每種脂質分子的信號，并根據培養物OD600nm進行標準化。每個數據點代表一個生物學重復（n=5），誤差線表示均值的SD。P值采用多重非配對t檢驗，并用Holm-?idák方法校正，比較GGA處理組與未處理菌株。未檢測到顯著差異。精確P值：30:0（P=0.999），31:0（P=1.000），32:0（P=0.090），33:0（P=0.999），34:0（P=0.419），35:0（P=0.996）。

GGA抑制SaeRS雙組分系統，并提示還存在其他轉錄調控靶點

在排除蛋白酶誘導和膜磷脂摻入后，研究團隊推測GGA可能抑制調控CWA蛋白豐度的轉錄調控系統。已有研究顯示，宿主來源的游離脂肪酸可抑制SaeRS雙組分系統，從而影響毒力因子的產生。不飽和脂肪酸對Sae系統的抑制強于飽和脂肪酸，其效力還受到不飽和程度和順反構型影響，這與本研究SAR結果一致。

SaeRS可正向調控CWA纖連蛋白結合蛋白FnBPs。研究者通過全細胞裂解液免疫印跡和saeS轉座子突變株的FnBP表面豐度檢測證實了這一點。GGA處理并不會進一步降低saeS::Tn突變株中的FnBP水平；當fnbA通過pALC2073質粒上的TetR控制型Pxyl/tetO啟動子過表達時，GGA也不再降低FnBP水平。質粒介導的構成性表達繞過了SaeRS調控，使fnbA轉錄在GGA處理下仍可維持。進一步地，研究者使用Pcoa-lacZ報告系統作為Sae活性指示，發現GGA對SaeRS的抑制與陽性對照油酸相當。

然而，GGA不僅降低FnBP豐度，還能抑制角蛋白黏附，并降低SpA和IsdA水平。金黃色葡萄球菌對角蛋白的黏附以及ClfB、SpA、IsdA等CWA蛋白的調控，過去并未與SaeRS明確關聯。因此，研究團隊進一步分析脂肪酸如何影響這些現象，以及這些影響是否發生在轉錄層面。

首先，研究者考察GGA抑制角蛋白黏附的機制。角蛋白黏附主要由ClfB介導，ClfB是金黃色葡萄球菌主要的細胞壁錨定角蛋白黏附蛋白。實驗顯示，GGA處理降低clfB轉錄水平；但刪除saeRS并未改變clfB豐度，也不影響角蛋白黏附。此外，即使在saeS::Tn突變株中，GGA仍可抑制對角蛋白的黏附，并降低clfB轉錄水平。這些數據說明，GGA通過降低clfB轉錄減少金黃色葡萄球菌對角蛋白的親和力，而這一過程與SaeRS系統無關。

與此一致，saeS::Tn突變株表面SpA水平升高，而IsdA不變；但GGA處理仍可降低該菌株中的SpA和IsdA。雖然在saeRS破壞和GGA處理后檢測spa轉錄水平時，由于變異較大未能得到明確結論，但當通過pALC2073質粒過表達spa、繞過轉錄調控時，GGA對SpA表面水平的影響消失。這些結果提示，除SaeRS外，GGA很可能還抑制其他轉錄調控因子。

圖5：GGA抑制SaeRS以及其他負責控制金黃色葡萄球菌細胞壁錨定蛋白的轉錄調控因子。（A）MRSA USA300 JE2（JE2）-ΔspaΔsbi細胞和JE2-saeS::Tn ΔspaΔsbi細胞在加入或不加入10 μM GGA處理時，細胞表面纖連蛋白結合蛋白（FnBPAB）豐度；（B）當fnbA通過質粒表達（pALC2073）時，JE2-ΔspaΔsbi加入或不加入10 μM GGA處理后的FnBPAB豐度。JE2-?fnbAB作為陰性對照。A至F每組均進行3個生物學重復。數據表示為均值 +/- SD。P值采用單因素ANOVA結合Tukey多重比較檢驗計算，P ≤ 0.01**，P ≤ 0.0001****，ns表示無顯著性。（C）檢測GGA對SaeRS活性的影響。MRSA USA300 AH1263加入或不加入10 μM GGA時的Pcoa-lacZ活性。油酸（OA，31.4 μM）作為陽性對照。P值采用單因素ANOVA結合Dunnett多重比較檢驗計算，P ≤ 0.001***。（D）采用ELISA法檢測JE2和JE2-saeS::Tn加入或不加入10 μM GGA時對角蛋白（0.5 μg/孔）的黏附。JE2-srtA::Tn作為陰性對照。相關結果見圖S9。P值采用單因素ANOVA結合Tukey多重比較檢驗計算。精確P值：JE2+GGA（相對于JE2），P=0.040；JE2-srtA::Tn（相對于JE2），P=0.003；JE2-saeS::Tn（相對于JE2），P=0.326；JE2-saeS::Tn+GGA（相對于JE2-saeS::Tn），P=0.326。（E）固定化JE2和JE2-saeS::Tn加入或不加入10 μM GGA時，細胞表面SpA和IsdA豐度；對應陰性對照分別為JE2-spa::Tn和JE2-isdA::Tn。P值采用單因素ANOVA結合Tukey多重比較檢驗計算。缺乏相應細胞壁錨定蛋白的突變株作為陰性對照。SpA ELISA的精確P值：JE2+GGA（相對于JE2）：P=0.0002；JE2-saeS::Tn（相對于JE2），P=0.0004；JE2-spa::Tn（相對于JE2），P<0.0001；JE2-saeS::Tn+GGA（相對于JE2-saeS::Tn），P=0.0004。IsdA ELISA的精確P值：JE2+GGA（相對于JE2），P=0.0052；JE2-isdA::Tn（相對于JE2），P<0.0001；JE2-saeS::Tn+GGA（相對于JE2-saeS::Tn），P=0.0007。（F）當spa通過質粒表達（pALC2073）時，JE2-ΔspaΔsbi細胞加入或不加入10 μM GGA后的表面SpA豐度。每個數據點代表一個生物學重復，誤差線表示均值的SD。P值采用單因素ANOVA結合Dunnett多重比較檢驗計算，將每個菌株與野生型菌株比較。P ≤ 0.05*，P ≤ 0.01**，P ≤ 0.001***，P ≤ 0.0001****，ns表示無顯著性。精確P值：JE2?spa?sbi-pspa+GGA（相對于JE2?spa?sbi-pspa），P=0.123；JE2?spa?sbi（相對于JE2-pspa），P<0.0001。（G）GGA介導抑制金黃色葡萄球菌轉錄調控因子、降低其對宿主配體黏附的機制示意圖。

轉錄組時間序列進一步證實GGA影響毒力通路

為了更系統地比較GGA處理與saeS破壞對金黃色葡萄球菌的影響，研究者進行了轉錄組時間序列分析。選擇時間序列策略，是因為毒力基因表達會隨細菌生長周期變化，這有助于完整捕捉GGA對金黃色葡萄球菌毒力通路的影響。

結果顯示，saeS破壞后下調的基因與既往研究一致，涵蓋溶血素、黏附素、蛋白酶、磷脂酶和白細胞毒素等關鍵毒力因子，包括fnbA、fnbB、hla、sbi、lukH和lukG。GGA處理在很大程度上復制了saeS::Tn突變株的轉錄表型，進一步證實其能夠干擾SaeRS雙組分系統。

與此同時，GGA還誘導了不同于saeS破壞的轉錄改變，提示其還影響其他細胞通路和靶點。與前述結果一致，在OD600nm為0.6、也就是角蛋白黏附最適階段時，GGA處理使clfB表達降低超過5倍；而saeRS突變株中clfB轉錄并未改變。GGA還抑制了一些在saeS破壞后未改變的毒力相關基因，包括編碼黏附素的spa和clfB、酚溶性調節肽相關基因、嘌呤和嘧啶生物合成相關基因（pyrF/E、purA/P/R/B）以及外排泵norB。

此外，與既往關于10 μM亞油酸影響金黃色葡萄球菌全局轉錄變化的研究一致，GGA也刺激了VII型分泌系統和脲酶基因表達。值得注意的是，編碼脂肪酸外排泵FarE的farE是GGA處理后上調最顯著的基因，提示細菌可能通過外排該化合物產生適應性反應。總體來看，研究者未進一步找到能夠解釋GGA降低clfB和spa的其他候選調控因子或通路。盡管如此，GGA介導clfB和spa下調，同時降低IsdA和FnBPs等CWA蛋白的表面豐度，提示其對CWA蛋白具有協調性轉錄抑制作用。這些發現強烈提示，GGA可通過干擾不同轉錄調控因子，廣泛調節金黃色葡萄球菌毒力機制，這也是未來研究的重要方向。

圖6：對缺乏saeS的金黃色葡萄球菌（JE2-saeS::Tn）與GGA處理細胞進行轉錄組時間序列分析，證實GGA抑制SaeRS，并揭示額外轉錄變化，提示GGA可能還存在其他細胞靶點。（A）火山圖顯示MRSA USA300 JE2（JE2）在saeS破壞（JE2-saeS::Tn，上方圖）和GGA（10 μM）處理（下方圖）后的差異表達基因及其統計顯著性。樣本在三個生長階段采集，分別為OD600nm 0.3、0.6和1.0。顯著差異表達基因（雙側Wald檢驗，Benjamini和Hochberg假發現率FDR校正后P<0.05）以橙色（上調）和藍色（下調）突出顯示，灰色線表示判定基因上調或下調的邊界。相關結果見Supplementary Data 3。（B）維恩圖顯示saeS破壞與GGA處理所改變基因集合之間的重疊和各自特異性。（C）基因本體（gene ontology，GO）分析顯示，GGA處理后差異表達基因富集于致病相關生物過程。該分析將三個時間點檢測到的所有差異表達基因合并后進行。氣泡圖顯示富集的GO生物過程，氣泡大小與每一類別中識別到的基因數量成比例，顏色標尺對應每個富集過程的假發現率（FDR，單側Fisher精確檢驗），并經Benjamini-Hochberg方法對P值進行多重檢驗校正。基因比例通過參與該GO生物過程的基因數量除以輸入基因總數計算。氣泡圖使用R語言中的ggplot2生成。

GGA對多重耐藥臨床分離株具有抗黏附作用，并在小鼠感染模型中顯示體內效果

為了支持后續轉化研究，研究團隊進一步評估GGA對一組多重耐藥金黃色葡萄球菌臨床分離株的作用。這些分離株來源不同，并對甲氧西林、氟喹諾酮類和大環內酯類抗生素耐藥。在這一多樣化菌株集合中，GGA持續表現出抗黏附作用。

鑒于既往研究中GGA作為癌癥預防候選物已有一定安全性資料，研究者進一步評估其在小鼠中的耐受性以及處理MRSA感染的能力。在脫毛小鼠側腹部皮下注射細菌接種物時，同時加入0.067 mg/kg GGA。結果顯示，這一給藥方式耐受性良好，并可有效阻止MRSA誘導的皮膚壞死性病灶形成。與載體處理相比，GGA給藥使細菌負荷顯著降低約2個log，顯示其具有抗MRSA活性，并可能具有殺菌作用。

考慮到GGA與細菌同時給藥可能在接種前即產生殺菌影響，研究者進一步檢測GGA的抗菌活性。在胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）中進行藥敏實驗時，GGA僅表現出較弱抗菌活性，最低抑菌濃度≥200 μM。然而，在TSB中未觀察到GGA的濃度依賴性殺菌效應；而在磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）中，GGA表現出殺菌作用，孵育8小時后可清除超過99.9%的細菌。

這些發現提示，GGA在體內的作用可能同時與毒力機制破壞和對MRSA的殺菌活性有關。進一步實驗顯示，在感染后給予GGA也可顯著減小皮膚壞死性病灶面積。研究者認為，這一現象更可能歸因于毒力因子抑制，因為感染后48小時細菌負荷仍較高，但疾病嚴重程度已經下降。

圖7：GGA對多重耐藥金黃色葡萄球菌臨床分離株的抗黏附活性、抗菌評估及體內效果。（A）GGA處理（10 μM）降低臨床分離株對角蛋白的黏附（Abs450nm）（n=3個生物學重復）。除分離株C0640和C0681使用0.125 μg/孔角蛋白檢測外，其余角蛋白濃度為0.0625 μg/孔。數據點代表單個生物學重復，誤差線表示均值的標準差（SD）。與未處理親本菌株相比，統計顯著性采用雙尾非配對Student’s t檢驗表示為P ≤ 0.05*；P ≤ 0.01**；P ≤ 0.001***；P ≤ 0.0001****。相關結果見圖S10和表S3。精確P值：C017+GGA（相對于C017），P=0.0001；C022+GGA（相對于C022），P=0.0004；C033+GGA（相對于C033），P=0.0003；C0489+GGA（相對于C0489），P=0.008；C0633+GGA（相對于C0633），P=5.7E-05；C0640+GGA（相對于C0640），P=0.019；C0681+GGA（相對于C0681），P=0.001。（B）在Balb/c小鼠MRSA USA300 LAC皮膚和軟組織感染模型中（n=8），0.067 mg/kg GGA在感染后48小時（hpi）顯著降低病灶面積和細菌負荷（CFU）。小鼠經皮下感染2.9 × 10^7 CFU，該接種物與載體或GGA混合；感染后6小時再皮下注射50 μL GGA（0.067 mg/kg）或載體。每個數據點代表一個獨立病灶，誤差線表示測量值的SD。數據表示為均值 +/- SD。統計顯著性采用雙尾非配對t檢驗并進行Welch校正，表示為P ≤ 0.001和P ≤ 0.0001**。組織總CFU/克的精確P值：GGA（相對于載體），P=0.0002；病灶面積GGA（相對于載體），P<0.0001。圖中顯示感染后48小時皮膚病灶代表性照片。比例尺為0.2 cm。（C）GGA對MRSA USA300菌株JE2（JE2）的藥敏測試。在遞增GGA濃度存在下檢測18小時生長。數據點表示3個生物學重復的平均值 ± SD。（D）時間-殺菌動力學實驗顯示，GGA在磷酸鹽緩沖液（PBS）中表現出時間依賴性殺菌活性。數據表示為3個生物學重復的均值 ± 標準差（SD）。（E）感染后給予GGA可在Balb/c小鼠皮膚感染模型中拮抗MRSA USA300 LAC。小鼠經皮下感染2.9 × 10^7 CFU。在感染后1小時和7小時，于每個感染部位皮下注射載體對照或GGA（0.067 mg/kg）。每個數據點代表感染后48小時的一個獨立病灶，誤差線表示測量值的SD（n=8）。數據表示為均值 +/- SD。統計顯著性采用雙尾非配對t檢驗并進行Welch校正，表示為P ≤ 0.05和P ≤ 0.0001***。組織總CFU/克的精確P值：GGA（相對于載體），P=0.030；病灶面積GGA（相對于載體），P=0.0005。圖中顯示感染后48小時皮膚病灶代表性照片。比例尺為0.5 cm。

【Citation】:Leonard, A. C., Bao, R., Menjivar, C., Myers, M. J., Paiva, T. O., Zheng, Z., Berry, K. A., Bayles, K. W., Flannagan, R. S., Dufrêne, Y. F., Bose, J. L., Heinrichs, D. E., & Cox, G. An anti-adhesive compound modulating the production of Staphylococcus aureus cell wall-anchored proteins.Nature Communications(2026).

【貢獻】★★★★★

總體而言，本研究支持脂肪酸，尤其是GGA，作為具有前景的抗MRSA候選物。其抗毒力活性主要通過抑制轉錄調控因子發揮作用。未來研究應重點闡明該化合物的精確分子靶點，進一步評估其體內作用效果及其與現有抗菌藥物聯用時的協同潛力，并謹慎評估MRSA對這一干預策略產生耐受或耐藥的風險。

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