動脈血栓是心肌梗死和缺血性中風的主要誘因。血小板活化在血栓形成中扮演核心角色，因此抑制血小板功能成為治療動脈血栓的關鍵策略。目前臨床常用的抗血小板藥物包括環(huán)氧化酶抑制劑、ADP受體拮抗劑等，但這些藥物存在出血風險或療效局限。天然產(chǎn)物因其副作用較小的特點受到關注。

瑞香素是從瑞香屬植物中提取的香豆素衍生物，在國內(nèi)已被用于治療凝血性疾病，但其抗血小板作用的分子機制尚未明確。一項發(fā)表于International Journal of Molecular Sciences的研究揭示了瑞香素通過調(diào)控細胞質(zhì)磷脂酶A2（cPLA2）磷酸化減少血栓素A2生成，從而抑制血小板活化的新機制。

研究目的

本研究旨在利用小鼠血小板模型，探討瑞香素對血小板功能的影響，闡明其調(diào)節(jié)血小板活化的分子機制，特別是瑞香素是否通過影響血栓素A2生成及相關信號通路來發(fā)揮抗血小板作用。

研究方法

研究采用C57BL/6小鼠，分離洗滌血小板。使用Lumi-aggregometer檢測血小板聚集和致密顆粒分泌（通過ATP釋放監(jiān)測）。采用ELISA試劑盒測量血栓素B2（血栓素A2的穩(wěn)定代謝物）生成量。通過免疫印跡法檢測cPLA2、ERK和AKT的磷酸化水平。實驗中使用了膠原、2-甲硫基腺苷二磷酸（2-MeSADP）和凝血酶作為血小板激動劑，部分實驗用阿司匹林預處理血小板以阻斷血栓素A2生成。

研究結果

瑞香素對GPVI介導的血小板反應影響較小。研究首先用不同濃度膠原刺激血小板。瑞香素以劑量依賴方式抑制了致密顆粒分泌，但僅在高濃度下才顯著抑制血小板聚集。這與秦皮乙素等其他香豆素衍生物不同，后者能夠強力阻斷膠原誘導的聚集。提示瑞香素在GPVI信號通路中作用有限。

注：（A）在不同濃度的瑞香素存在下，用GPVI激動劑3 ?g/ml、5 ?g/ml和7.5?g/ml的膠原刺激洗滌后的小鼠血小板3.5min。在 Lumi-aggregometer中分析血小板聚集（上）和ATP分泌（下）。數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗（n=3）。對圖A中的（B）聚集程度和（C）致密顆粒分泌進行定量。（B）聚集程度和（C）致密顆粒分泌的數(shù)據(jù)表示為平均值$F_{22}$ ?標準誤 *，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.005；****，P＜0.0001

圖1 瑞香素對膠原誘導的血小板聚集和分泌的影響

瑞香素完全抑制2-MeSADP誘導的二次聚集和分泌波。使用ADP類似物2-MeSADP刺激血小板時，瑞香素完全抑制了低濃度和高濃度誘導的二次聚集波以及致密顆粒分泌。已知二次聚集波依賴于血栓素A2的正反饋效應。為了驗證這一點，研究者用阿司匹林預處理血小板以阻斷血栓素A2生成。在阿司匹林處理后的血小板中，瑞香素不再對2-MeSADP誘導的聚集產(chǎn)生額外抑制作用。這說明瑞香素的作用靶點正是血栓素A2的生成過程。

注：（A）在不同濃度的瑞香素存在下，用30 nM、50 nM和100 nM的2-MeSADP刺激洗滌過的小鼠血小板。所有數(shù)據(jù)均代表三次獨立實驗的結果（n=3）。對圖A中的（B）聚集程度和（C）致密顆粒分泌進行定量分析。數(shù)據(jù)以平均值±?標準誤***表示，P＜0.001；****，P＜0.0001

圖2 瑞香素對非阿司匹林化血小板中2-甲硫基腺苷二磷酸誘導的聚集和分泌的影響

瑞香素僅抑制低濃度凝血酶誘導的血小板活化。凝血酶是更強的血小板激動劑。低濃度凝血酶誘導的聚集和分泌依賴血栓素A2的正反饋，而高濃度凝血酶不依賴這些信號。結果顯示，瑞香素僅抑制了低濃度凝血酶誘導的聚集和分泌，對高濃度凝血酶無影響。這進一步支持瑞香素通過阻斷血栓素A2生成來發(fā)揮作用。

注：（A）在不同濃度的瑞香素存在下，用0.1 U/ml、0.3 U/ml和0.5 U/ml的凝血酶刺激洗滌過的小鼠血小板。對圖A中的（B）聚集程度和（C）致密顆粒分泌進行定量。數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗（n=3），以平均值±?標準誤*表示，P＜0.05；**，P＜0.01；****，P＜0.0001

圖3 瑞香素對凝血酶誘導的血小板聚集和分泌的影響

瑞香素顯著減少血栓素A2生成。研究直接測量了血小板中血栓素B2的水平。瑞香素以劑量依賴方式顯著抑制了2-MeSADP和凝血酶誘導的血栓素B2生成，證實了其對血栓素A2合成通路的阻斷作用。

注：洗滌后的小鼠血小板在37下，在不同濃度的瑞香素存在下，分別用（A）100 nM 2-MeSADP和（B）0.1 U/ml和0.5 U/ml凝血酶刺激3.5min，并在攪拌條件下，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法重復測量TxB2生成量。數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗（n=3），并以平均值±?標準誤**P＜0.01***，P＜0.001；****P＜0.0001表示

圖4 瑞香素對2-甲硫基-腺苷二磷酸和凝血酶誘導的血小板中血栓素A2生成的影響

瑞香素直接抑制cPLA2磷酸化，對ERK的抑制是間接效應。在未用阿司匹林處理的血小板中，2-MeSADP誘導的cPLA2磷酸化和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶磷酸化均被瑞香素抑制。在使用阿司匹林阻斷血栓素A2生成后，瑞香素仍然完全抑制cPLA2磷酸化，但對ERK磷酸化沒有影響。這表明瑞香素直接靶向cPLA2磷酸化，而非通過ERK間接發(fā)揮作用。瑞香素對ERK磷酸化的抑制實際上是血栓素A2生成減少后的下游結果。此外，瑞香素不影響蛋白激酶B磷酸化，排除了PI3K-AKT通路的參與。

注：（A）在37下，用不同濃度的瑞香素處理洗滌后的血小板，并在100 nM 2-MeSADP的刺激下孵育2min。加載對應于相同數(shù)量血小板的裂解液體積。用抗磷酸化cPLA2、抗cPLA2、抗磷酸化ERK、抗ERK、抗磷酸化AKT或抗AKT抗體檢測膜。所示數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗（n=3）。對（B）非阿司匹林處理和（C）阿司匹林處理的血小板中的印跡進行定量，并以平均值±?標準誤表示，***，P＜0.001；****，P＜0.0001

圖5 瑞香素對2-甲硫基腺苷二磷酸誘導的血小板中cPLA2和ERK磷酸化的影響

綜上，瑞香素通過直接抑制cPLA2磷酸化，減少花生四烯酸釋放，從而降低血栓素A2生成。血栓素A2減少又削弱了對血小板的正反饋激活，最終抑制了由ADP和低濃度凝血酶誘導的血小板聚集和分泌。這項研究首次闡明了瑞香素抗血小板作用的分子基礎，將其作用機制定位于cPLA2磷酸化這一環(huán)節(jié)，為開發(fā)新型抗血栓藥物提供了潛在先導化合物。

參考文獻

Chaudhary，P.K.，Kim，S，Kim,，S.瑞香素在小鼠體內(nèi)的抗血小板作用受cPLA2介導的血栓素A2生成的調(diào)控[J].Int.J.Mol.Sci，2023，24：5779.