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蛋白質翻譯后修飾（post-translational modifications, PTMs）決定了蛋白質在細胞中的真實功能狀態，其中以糖基化與磷酸化最具系統調控意義。然而，在實際蛋白組學研究中，由于樣本拆分、并行處理、分別富集，再在計算層面勉強拼接，這些信息長期被迫分散在不同實驗流程中獲取。

這種策略在方法學上并非優雅的選擇，而是一種歷史妥協——它帶來的問題并不隱蔽：樣本損耗成倍放大、流程時間冗長、批次效應疊加、定量一致性被結構性削弱。

來自中國科學院、重慶醫科大、南昌贛江中藥創新中心等研究團隊提出并系統驗證了一種順序式多 PTM 蛋白組學平臺MuPPE（Multiplexed PTM Proteomics by Protein Aggregation）。其核心思想是在單一樣本、單一反應體系中，依次完成蛋白組、糖基化蛋白組與磷酸化蛋白組的捕獲與解析，從根本上重構多 PTM 蛋白組學的工程邏輯。

相關研究內容以「A versatile platform for sequential glyco-, phospho-, and proteomics with multi-PTMs integration」為題，于 2026 年 1 月 28 日發布在《Nature Communications》。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-68270-7

蛋白聚集驅動的順序式富集

傳統多 PTM 蛋白組學流程的核心假設，是不同修飾類型需要彼此獨立的富集化學環境與處理條件。因此，研究者通常在樣本裂解后即進行拆分，每一份樣本對應一種 PTM 富集策略。

這一做法在概念上簡單，卻在工程上代價高昂。首先，樣本拆分會直接降低每一分支的起始物質量，使得低豐度修飾位點更易丟失；其次，不同富集流程之間不可避免地產生處理偏差，最終反映為定量噪聲的系統性放大；更關鍵的是，這種并行流程天然不適用于樣本量受限的場景，如臨床體液或稀有組織。

研究團隊在論文中明確指出，問題并不在于富集材料或質譜靈敏度的不足，而在于流程結構本身并不為「多層信息一致性」服務。MuPPE 正是在這一判斷基礎上被提出，其目標不是增加某一 PTM 的覆蓋率，而是在同一物理樣本軌跡中，最大限度保留不同修飾層之間的真實對應關系。

圖 1：MuPPE 平臺實現了集成的多層次蛋白質組學，提升了效率和覆蓋范圍。

MuPPE 平臺是一個整合蛋白質聚集捕獲（PAC）、珠上消化和序列 PTM 富集的統一流程。作為原理驗證，該平臺使蛋白質組、糖蛋白組和磷蛋白組同時被探測成為可能。它從蛋白質變性、還原和烷基化開始，引入一種經過修改且可擴展的 PAC 方法，實現高效的蛋白質分離。

隨后，研究者通過精心設計的順序洗脫與酶解策略，使不同修飾層在同一載體上被依次釋放并分析。整個過程中，樣本始終處于單管、單體系中完成，沒有發生任何物理拆分。這種順序式設計的直接結果，是樣本損耗被系統性壓縮，同時不同修飾層之間的相對定量關系得以最大程度保留。

效率、一致性與覆蓋度的系統評估

在方法學評估中，研究團隊首先對 MuPPE 與傳統并行富集流程進行了直接對比。在處理時間上，MuPPE 將完整多 PTM 分析流程壓縮至約 4 小時，相較傳統方法動輒 24–36 小時的處理周期，時間成本降低約 87.5%。這一壓縮并非通過減少步驟實現，而是通過消除并行流程中的冗余處理完成。

在定量一致性方面，MuPPE 在多個生物重復實驗中表現出顯著更低的變異系數。無論是蛋白組、糖基化蛋白組還是磷酸化蛋白組，變異系數（CV%）均穩定維持在約 12–15% 區間（平均 CV = 12.3%，而溶液中消化為 17.6%），而傳統并行方法在相同條件下普遍超過 20%。

圖 2：使用 MuPPE 對糖蛋白組、磷酸蛋白組和蛋白質組進行序列化分析。

覆蓋度分析顯示，MuPPE 在不犧牲深度的前提下，實現了對三類分子層級的穩定檢測。數千個蛋白、上萬條糖基化與磷酸化位點在單次實驗中被同時解析，且不同修飾層之間的對應關系清晰可追溯。這一點在后續的生物學應用中尤為關鍵。

圖 3：小鼠衰老隊列的磷蛋白組、糖蛋白組和蛋白質組整合分析。

應用層面，MuPPE 適用于多種復雜生物樣本，包括血清、腦組織以及腦脊液等低起始量或高復雜度體系。該平臺在樣本量受限條件下依然保持穩定的檢測能力，且不同 PTM 層的信號強度與定量分布高度一致。

值得注意的是，論文并未刻意放大某一具體生物學發現，而是將重點放在方法本身在真實樣本條件下的穩健性驗證。這種克制的呈現方式，反而凸顯了 MuPPE 作為平臺級工具的通用潛力。

針對流程結構的蛋白組學重構

MuPPE 首次實現了單一樣本中糖基化、磷酸化與總蛋白的串聯分析，解決了傳統方法樣本需求量大、修飾間關聯性難以捕捉的痛點。其在低樣本量、高復雜性樣本中表現出優異的富集效率和重現性，拓展了未注釋 PTM 位點的發現。

該平臺目前對單細胞水平的低蛋白樣本仍需進一步優化，但不妨礙它在效率、一致性與樣本利用率之間實現了難得的平衡。對于需要在有限樣本中同時解析多層蛋白修飾信息的研究場景而言，這種工程層面的改變，可能比單一指標的提升更具長期影響。