近日，高致病性病毒與生物安全全國重點實驗室/武漢大學生命科學學院/泰康生命醫(yī)學中心藍柯研究組在國際學術(shù)期刊Journal of Virology發(fā)表了題為Repression of EEF1D by KSHV RTA Promotes Viral Lytic Reactivation的研究論文。該研究揭示了卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）裂解復制開關(guān)分子RTA作為轉(zhuǎn)錄抑制因子下調(diào)宿主抗病毒蛋白EEF1D從而促進病毒裂解復制的新機制。

卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV），又稱人類皰疹病毒 8 型（HHV-8），是導致卡波西肉瘤（KS）、原發(fā)性滲出性淋巴瘤（PEL）和多中心卡斯特曼病（MCD）的主要病原體。KSHV 在宿主體內(nèi)主要以潛伏感染（Latency）狀態(tài)存在，此時病毒基因組保持靜默，僅表達極少數(shù)基因以逃避宿主免疫清除。然而，在特定環(huán)境刺激下，病毒會進入裂解性激活（Lytic Reactivation）階段。這一過程對于病毒的水平傳播及致病性至關(guān)重要，因為大量的病毒顆粒產(chǎn)生會導致細胞裂解和炎癥反應。這一轉(zhuǎn)變的“總開關(guān)”是病毒編碼的復制與轉(zhuǎn)錄激活因子（RTA）。雖然 RTA 的促激活作用已被廣泛研究，但宿主細胞如何通過限制 RTA 的功能來維持潛伏狀態(tài)，以及 RTA 如何反過來瓦解這些宿主“防御枷鎖”，仍是病毒學領(lǐng)域的核心課題。
本研究聚焦于真核翻譯延伸因子EEF1D（eukaryotic translation elongation factor 1δ）。傳統(tǒng)上認為 EEF1D 參與蛋白質(zhì)合成，但其在病毒生活周期調(diào)節(jié)中的非經(jīng)典功能此前尚不明確。本文采用了分子生物學、生物化學與遺傳學相結(jié)合的多維度實驗方案，即（1）功能篩選與驗證： 利用 CRISPR/Cas9 基因敲除技術(shù)和過表達實驗，觀察 EEF1D 水平變化對 KSHV 裂解基因表達（如 ORF50/RTA, ORF45, K8）及病毒滴度的影響。（2）蛋白質(zhì)相互作用分析： 通過共免疫沉淀（Co-IP）和免疫熒光共定位實驗，檢測 RTA 蛋白與 EEF1D 之間的物理結(jié)合。（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究：采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒↙uciferase Assay）和定量 PCR（RT-qPCR），評估 RTA 是否在轉(zhuǎn)錄水平上抑制 EEF1D基因的啟動子活性。（4）蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實驗：使用蛋白質(zhì)合成抑制劑（放線菌酮，CHX）處理細胞，觀察 RTA 存在下 EEF1D 蛋白的降解動力學，并利用蛋白酶體抑制劑（MG132）探究其降解途徑。（5）進化保守性分析： 對其他靈長類（如恒河猴 rKSHV）及嚙齒類（如 MHV-68）的 γ-皰疹病毒同源蛋白進行對比實驗，分析該機制的進化演變。
實驗結(jié)果顯示，敲除 iSLK-RGB 等細胞系中的 EEF1D 會顯著增強 KSHV 的裂解性基因表達，并增加子代病毒的產(chǎn)生。相反，過表達 EEF1D 則能有效抑制 RTA 誘導的病毒激活。這表明 EEF1D 在生理條件下起到了“分子剎車”的作用，維持病毒的潛伏狀態(tài)。
研究發(fā)現(xiàn)，KSHV 的 RTA 蛋白演化出了一種極為高效的策略，從兩個層面清除 EEF1D 的阻礙，即RTA 對 EEF1D 的雙重打擊機制：

• 轉(zhuǎn)錄抑制：RTA 能夠結(jié)合在 EEF1D 基因的啟動子區(qū)域，通過抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從源頭上減少 EEF1D mRNA 的產(chǎn)量。

• 翻譯后降解：RTA 充當了 E3 泛素連接酶或其招募者，與 EEF1D 直接結(jié)合并誘導其通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解。這是首次證明 RTA 具有靶向降解該類延伸因子的能力。

通過截短體突變實驗，研究確定了 RTA 的 C 端轉(zhuǎn)錄激活域?qū)ζ湟种?EEF1D 至關(guān)重要。同時，RTA 的特定基序負責與 EEF1D 結(jié)合，這一發(fā)現(xiàn)為未來篩選阻斷該相互作用的小分子藥物提供了靶點。研究進一步發(fā)現(xiàn)，這種“RTA-EEF1D 拮抗軸”在人類 KSHV 和恒河猴 rKSHV 中高度保守，但在鼠類 γ-皰疹病毒 MHV-68 中并不存在。這暗示該機制是靈長類皰疹病毒在長期進化中為了適應宿主環(huán)境而獲得的特有策略。

RTA抑制EEF1D以促進KSHV裂解復制的機制示意圖

由于既往尚沒有KSHV RTA作為轉(zhuǎn)錄抑制因子的報道，團隊深入研究了RTA轉(zhuǎn)錄抑制EEF1D的功能機制，發(fā)現(xiàn)這一抑制作用是由RTA通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A相互作用，并與另一轉(zhuǎn)錄因子PATZ1形成復合物，最終由PATZ1將該復合物招募至EEF1D的啟動子區(qū)域從而引起EEF1D啟動子超甲基化和轉(zhuǎn)錄抑制。有趣的是，KSHV RTA作為轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制EEF1D轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象在靈長類γ皰疹病毒中具有保守性。

總之，該研究首次揭示了KSHV RTA可作為轉(zhuǎn)錄抑制因子下調(diào)宿主抗病毒蛋白從而促進病毒裂解復制，拓展了對RTA功能的認識，并為理解KSHV再激活裂解復制機制提供了新的見解。

武漢大學生命科學學院博士研究生向敏為該論文的第一作者，藍柯教授為通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金、國家重點研發(fā)計劃等項目的資助。