首次建立了人源成年肝細(xì)胞類器官（h-HepOrgs）的長期擴(kuò)增體系，這篇 Nature 論文能教你搞定類器官的相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[1]。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的完美閉環(huán)

今天分析的這篇文章，主要是想帶大家看看頂刊團(tuán)隊(duì)是如何從細(xì)胞來源突破到多細(xì)胞組裝、從功能驗(yàn)證到疾病建模，形成一個(gè)完美的閉環(huán)。

• 文章亮點(diǎn)：首次建立了人源成年肝細(xì)胞類器官（h-HepOrgs）的長期擴(kuò)增體系，并將其與膽管細(xì)胞類器官、門靜脈間質(zhì)細(xì)胞組裝成「人源門靜脈肝組裝體」，用于模擬肝臟疾病和藥物篩選。
  

• 設(shè)計(jì)思路：細(xì)胞來源突破 → 長期擴(kuò)增驗(yàn)證 → 功能表征 → 多細(xì)胞組裝 → 疾病建模 → 治療應(yīng)用。

• 適用領(lǐng)域：類器官、肝病建模、再生醫(yī)學(xué)。

• 發(fā)文思路：「類器官+多細(xì)胞組裝」。這篇文章的核心亮點(diǎn)不是單純「造了個(gè)肝細(xì)胞類器官」，而是將三種細(xì)胞類型組裝在一起，形成了「肝細(xì)胞+膽管細(xì)胞+間質(zhì)」的復(fù)合結(jié)構(gòu)，一下子就把模型的生理相關(guān)性提升到了新的高度，一下子就做出了新意。

具體實(shí)驗(yàn)思路

1、先解決核心挑戰(zhàn)：人源成年肝細(xì)胞類器官在體外難以長期擴(kuò)增：

解決方案：優(yōu)先找到促進(jìn)肝細(xì)胞擴(kuò)增的條件：研究人員分析了人肝癌類器官和小鼠肝部分切除術(shù)后再生肝組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）發(fā)現(xiàn) YAP 和 WNT 信號(hào)通路在肝細(xì)胞增殖中被激活。基于這一發(fā)現(xiàn)，他們在原有培養(yǎng)基中添加了 WNT 激動(dòng)劑（Wnt Surrogate）和 LATS1/2 抑制劑（TRULI）以激活 YAP 信號(hào)，成功實(shí)現(xiàn)了 h-HepOrgs 的長期傳代（>3 個(gè)月，>10 代，每周 1:2 傳代）。

更進(jìn)一步地優(yōu)化：去除煙酰胺（nicotinamide）可使類器官形成效率提高近 10 倍，最終確立了 h-HepOrg 擴(kuò)增培養(yǎng)基 EM2（MM + WntS + TRULI - Nic）。利用這一體系，研究團(tuán)隊(duì)從 28 例患者中 100% 成功建立了 h-HepOrgs，并創(chuàng)建了活體生物庫。

2、利用全面的分子表征證明 h-HepOrgs「像真的肝細(xì)胞」：

• RNA 測序：比較 h-HepOrgs 與原代人肝細(xì)胞（PHHs）的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)高度相關(guān)，而膽管細(xì)胞類器官（h-CholOrgs）則單獨(dú)聚類

• 基因集富集分析（GSEA）：h-HepOrgs 富集了增殖相關(guān)基因特征，類似肝部分切除后的再生肝組織

• 免疫熒光：h-HepOrgs 表達(dá) Ki-67 增殖標(biāo)志物，且 YAP 定位于細(xì)胞核（證實(shí)通路激活）

• 核型分析：長期培養(yǎng)后染色體數(shù)目保持穩(wěn)定

• 凍存復(fù)蘇：h-HepOrgs 可凍存復(fù)蘇而不喪失擴(kuò)增能力

這些結(jié)果表明，h-HepOrgs 保留了原代肝細(xì)胞的特征，同時(shí)獲得了穩(wěn)定的擴(kuò)增能力。

3、通過功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 h-HepOrgs 保留肝細(xì)胞關(guān)鍵功能：

• 膽汁小管結(jié)構(gòu)：透射電鏡觀察顯示，h-HepOrgs 形成了類似體內(nèi)肝組織的膽汁小管結(jié)構(gòu)（細(xì)長管腔）

• 白蛋白分泌：ELISA 檢測證實(shí) h-HepOrgs 分泌白蛋白

• 藥物代謝酶活性：檢測 CYP450 酶活性，證實(shí) h-HepOrgs 保留了藥物代謝功能

• 移植治療：將 h-HepOrgs 移植到肝病小鼠模型中，可恢復(fù)肝功能和肝小葉結(jié)構(gòu)，證明其體內(nèi)功能潛力

4、開始做「核心技術(shù)創(chuàng)新」：通過多細(xì)胞組裝構(gòu)建人源門靜脈肝組裝體

研究團(tuán)隊(duì)將 h-HepOrgs（肝細(xì)胞類器官）、h-CholOrgs（膽管細(xì)胞類器官，來自同一患者）、人源門靜脈間質(zhì)細(xì)胞（原代分離，通過 CD90+PDGFRα+分選富集）三種細(xì)胞按特定比例混合培養(yǎng)后，細(xì)胞自組裝形成了門靜脈肝組裝體（periportal liver assembloids）。這一結(jié)構(gòu)再現(xiàn)了體內(nèi)門靜脈區(qū)域的細(xì)胞排布：膽管細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞被包裹在肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)中，形成了類似體內(nèi)肝臟門靜脈區(qū)域的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

再通過免疫熒光染色顯示，組裝體中肝細(xì)胞標(biāo)志物（HNF4α、白蛋白）、膽管細(xì)胞標(biāo)志物（CK7、CK19）和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（α-SMA、vimentin）呈特征性分布。

5、通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)驗(yàn)證組裝體再現(xiàn)體內(nèi)基因表達(dá)模式

為了證明組裝體「像真的門靜脈區(qū)域」，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測序（scRNA-seq）分析。結(jié)果顯示：

• 組裝體中肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜與體內(nèi)相應(yīng)細(xì)胞高度一致

• 組裝體中肝細(xì)胞富集了脂肪酸代謝、補(bǔ)體、藥物代謝等經(jīng)典肝細(xì)胞功能基因

• 門靜脈區(qū)域特征基因（如 SAA1、SAA2、APOA1）在組裝體肝細(xì)胞中表達(dá)

• 細(xì)胞間相互作用相關(guān)基因在組裝體中被正確激活

這些結(jié)果證實(shí)，組裝體在細(xì)胞組成、空間排布和基因表達(dá)三個(gè)維度上都高度模擬了體內(nèi)門靜脈區(qū)域。

6、通過增加間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，用組裝體模型模擬膽道纖維化

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將組裝體用于疾病建模 —— 膽道纖維化。他們通過將門靜脈間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加 20 倍（從 25 個(gè)增加到 500 個(gè)），同時(shí)保持其他細(xì)胞數(shù)量不變，構(gòu)建了「纖維化樣組裝體」：

• 膠原沉積和基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)顯著增加

• 膽管細(xì)胞數(shù)量增加，呈現(xiàn)增殖表型（Ki-67 陽性）

• 肝細(xì)胞數(shù)量減少，伴隨凋亡增加

• 炎癥相關(guān)基因（TNF 信號(hào)、IL-4/IL-6、NF-κB、JAK-STAT）在肝細(xì)胞中富集

• TGF-β 信號(hào)通路在肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞中均被激活

• 部分肝細(xì)胞表達(dá)膽管細(xì)胞標(biāo)志物 KRT19，提示可能的轉(zhuǎn)分化

這些表型與臨床膽道纖維化患者（如原發(fā)性硬化性膽管炎、原發(fā)性膽汁性膽管炎）的轉(zhuǎn)錄組特征高度一致，為藥物篩選提供了「類器官層面」的疾病模型。

主要結(jié)果

1、成功建立了可長期擴(kuò)增的人源成年肝細(xì)胞類器官（h-HepOrgs）

從 28 例患者中 100% 成功建立 h-HepOrgs，可長期傳代 >3 個(gè)月（>10 代），建立了活體生物庫。關(guān)鍵突破在于：通過激活 YAP 和 WNT 信號(hào)通路，突破了人源成年肝細(xì)胞體外擴(kuò)增的技術(shù)瓶頸。

2、h-HepOrgs 保留了原代肝細(xì)胞的分子特征和功能

RNA-seq 顯示 h-HepOrgs 與原代肝細(xì)胞的基因表達(dá)譜高度相關(guān)，保留了膽汁小管結(jié)構(gòu)、白蛋白分泌和藥物代謝功能。移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在體內(nèi)可重建肝功能。

3、成功構(gòu)建了人源門靜脈肝組裝體，再現(xiàn)體內(nèi)組織排布

通過將 h-HepOrgs、h-CholOrgs 和門靜脈間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，構(gòu)建了包含三種細(xì)胞類型的復(fù)雜組裝體，再現(xiàn)了體內(nèi)門靜脈區(qū)域的組織學(xué)排布和細(xì)胞互作。

4、組裝體可用于模擬膽道纖維化和藥物篩選

增加門靜脈間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量可誘導(dǎo)組裝體發(fā)生纖維化反應(yīng)，表現(xiàn)為膠原沉積、膽管細(xì)胞增殖、肝細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。這些表型與臨床膽道纖維化患者高度一致，為抗纖維化藥物篩選提供了新平臺(tái)。

5、患者來源的組裝體保留了供體特異性特征

不同患者來源的 h-HepOrgs 和組裝體保留了供體特異性的基因表達(dá)譜，包括與肝臟疾病易感性相關(guān)的基因（如肝炎病毒感染的 IL1RL1 和 ERAP2、肝癌的 GPC3 等），為個(gè)性化疾病建模和藥物篩選提供了可能。

小編點(diǎn)評(píng)

這篇文章最值得借鑒的是它的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)邏輯：

第一，不是單純「造了個(gè)肝細(xì)胞類器官」，而是系統(tǒng)解決了人源成年肝細(xì)胞體外擴(kuò)增這一難題。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)發(fā)現(xiàn) YAP+WNT 激活方案，這種「組學(xué)引導(dǎo)」的策略值得借鑒。

第二，通過 RNA-seq、免疫熒光、電鏡、移植實(shí)驗(yàn)多維度證明類器官，這種多模態(tài)驗(yàn)證是頂刊的標(biāo)配，也是說服審稿人的關(guān)鍵。

第三，不是滿足于單一細(xì)胞類型，而是將三種細(xì)胞類型組裝成復(fù)合結(jié)構(gòu)，再現(xiàn)了體內(nèi)門靜脈區(qū)域的細(xì)胞排布和互作。從「單細(xì)胞類器官」到「多細(xì)胞組裝體」，是類器官領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。

第四，不僅構(gòu)建了健康狀態(tài)的模型，還通過增加間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量誘導(dǎo)纖維化表型，實(shí)現(xiàn)了從「生理模型」到「病理模型」的跨越。這種「模型構(gòu)建 → 疾病建模」的閉環(huán)，大大提升了研究的轉(zhuǎn)化價(jià)值。

第五，移植實(shí)驗(yàn)證實(shí) h-HepOrgs 可在體內(nèi)重建肝功能，這是再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的直接證據(jù)，為肝衰竭患者的細(xì)胞治療提供了新思路。

第六，從類器官培養(yǎng)技術(shù)，到多組學(xué)分析，到基因編輯，到活體移植，到疾病建模，每個(gè)技術(shù)都服務(wù)于回答問題，不是為了用技術(shù)而用技術(shù)。

對(duì)于時(shí)間有限或不熟悉多組學(xué)分析的研究者，這套「多細(xì)胞組裝+多組學(xué)驗(yàn)證+多模態(tài)表征」的設(shè)計(jì)范式值得反復(fù)推敲。它將類器官研究從「單細(xì)胞模型」推向「多細(xì)胞互作系統(tǒng)」，從「生理觀察」升級(jí)為「疾病模擬」，讓模型的生理相關(guān)性和臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值提升到了新的高度。

[1]. Yuan L, Dawka S, Kim Y, et al. Human assembloids recapitulate periportal liver tissue in vitro. Nature. 2026;650(8101):438-449. doi:10.1038/s41586-025-09884-1