導(dǎo)讀

蛋白-蛋白相互作用是調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過(guò)程的核心機(jī)制。深入解析蛋白互作與細(xì)胞行為之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系，對(duì)于理解腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥機(jī)制以及開(kāi)發(fā)精準(zhǔn)治療策略具有重要意義。然而，傳統(tǒng)檢測(cè)方法（如Co-IP、Western blot）依賴細(xì)胞裂解，只能提供群體平均化的“靜態(tài)快照”，無(wú)法反映單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)動(dòng)態(tài)。雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)雖可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞成像，但其大分子量熒光蛋白標(biāo)簽（>10 kDa）可能干擾蛋白天然功能，且轉(zhuǎn)染效率低，難以實(shí)現(xiàn)高通量單細(xì)胞分析。

針對(duì)活細(xì)胞中蛋白互作檢測(cè)效率低、通量不足等挑戰(zhàn)，北京航空航天大學(xué)常凌乾、董再再，香港城市大學(xué)焦艷麗，北京航空航天大學(xué)張靖（共同通訊作者）合作報(bào)道了一種名為“Pixar”的高通量單細(xì)胞生物芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)集成了蛇形微通道單細(xì)胞捕獲陣列與納米孔聚焦電場(chǎng)遞送模塊，能夠同時(shí)對(duì)數(shù)千個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)定位與高效分子遞送。通過(guò)遞送小分子肽標(biāo)簽（His/Flag，<1 kDa）標(biāo)記的蛋白表達(dá)質(zhì)粒及特異性DNA探針，Pixar系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中蛋白互作的高靈敏、可視化檢測(cè)，遞送效率與細(xì)胞活性均超過(guò)90%，成功避免了傳統(tǒng)大分子標(biāo)簽對(duì)蛋白功能的干擾?；谠撓到y(tǒng)，研究團(tuán)隊(duì)揭示了AKT-mTOR蛋白互作增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和增殖異質(zhì)性的調(diào)控作用，為精準(zhǔn)腫瘤治療提供了新的單細(xì)胞層面的理論依據(jù)（圖1）。成果以“High-Throughput Single-Cell Biochip System for Functional Interrogation of Protein Interactions in Living Cells”為題，發(fā)表在《Small》上。論文第一作者為北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士研究生劉馮、安徽醫(yī)科大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院碩士研究生吳成寶、北京航空航天大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院副教授楊超娟、北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士研究生童一航。

圖1. Pixar系統(tǒng)工作原理及單細(xì)胞蛋白互作檢測(cè)流程

Pixar系統(tǒng)首先通過(guò)蛇形微通道中的鉤狀微結(jié)構(gòu)，利用流體偏轉(zhuǎn)力實(shí)現(xiàn)了高通量單細(xì)胞捕獲（>1000個(gè)細(xì)胞/芯片，捕獲效率>90%）。隨后，利用納米孔聚焦電場(chǎng)技術(shù)，在30V低電壓下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜可逆電穿孔，將His/Flag小肽標(biāo)簽標(biāo)記的AKT和mTOR表達(dá)質(zhì)粒以及特異性DNA探針高效遞送至活細(xì)胞內(nèi)（遞送效率>96%，細(xì)胞活性>98%）。小分子肽標(biāo)簽（<1 kDa）相比傳統(tǒng)熒光蛋白標(biāo)簽（>10 kDa）對(duì)蛋白天然構(gòu)象和功能影響更小，同時(shí)探針通過(guò)適配體特異性識(shí)別肽標(biāo)簽，結(jié)合鏈置換信號(hào)放大策略，實(shí)現(xiàn)了蛋白互作信號(hào)4倍增強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度達(dá)1 nM（圖2）。

圖2. Pixar系統(tǒng)單細(xì)胞捕獲與分子遞送性能驗(yàn)證

基于上述技術(shù)優(yōu)勢(shì)，研究團(tuán)隊(duì)利用Pixar系統(tǒng)對(duì)AKT-mTOR蛋白互作進(jìn)行了單細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示，AKT-mTOR互作增強(qiáng)顯著促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖能力，且不同細(xì)胞間表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性響應(yīng)。通過(guò)蛋白組學(xué)分析，共鑒定出641個(gè)差異表達(dá)蛋白，GO和KEGG富集分析表明這些蛋白主要參與糖酵解、細(xì)胞黏附、代謝調(diào)控等通路，揭示了AKT-mTOR互作調(diào)控腫瘤細(xì)胞行為異質(zhì)性的分子網(wǎng)絡(luò)（圖3）。

圖3. Pixar系統(tǒng)監(jiān)測(cè)AKT-mTOR互作調(diào)控腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性

為進(jìn)一步驗(yàn)證Pixar系統(tǒng)的普適性，研究團(tuán)隊(duì)選擇了另一對(duì)經(jīng)典癌蛋白KRAS-Raf1進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，Pixar系統(tǒng)同樣能夠高效遞送KRAS和Raf1表達(dá)質(zhì)粒，并成功檢測(cè)到二者在活細(xì)胞中的特異性互作信號(hào)。經(jīng)KRAS抑制劑處理后，熒光信號(hào)顯著降低，證實(shí)了檢測(cè)的特異性。以上結(jié)果充分證明Pixar系統(tǒng)具有良好的通用性，適用于多種蛋白互作的研究場(chǎng)景（圖4）。

圖4. Pixar系統(tǒng)在AKT-mTOR蛋白互作檢測(cè)中的應(yīng)用驗(yàn)證

綜上所述，Pixar系統(tǒng)集高效遞送、多靶標(biāo)檢測(cè)、長(zhǎng)時(shí)程單細(xì)胞表型監(jiān)測(cè)于一體，為藥物篩選、基礎(chǔ)生物學(xué)研究及個(gè)性化醫(yī)療提供了全新的技術(shù)平臺(tái)。

文章鏈接：https://doi.org/10.1002/smll.73336

來(lái)源：北京航空航天大學(xué)