J Hepatol I LONP1 失守，乳清酸暴漲：揭開 MASH 肝纖維化的代謝驅動軸（孫倍成/武鵬凱/張振-安徽醫科大學）

2025年12月15日，安徽醫科大學孫倍成、武鵬凱、張振及新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院李治建團隊在肝病學領域權威期刊Journal of Hepatology（中科院1區，IF=33）在線發表題為 “Decreased LONP1 expression exacerbates MASH-induced liver fibrosis via elevated orotic acid levels” 的研究論文。該研究聚焦代謝功能障礙相關性脂肪性肝炎（MASH）進展過程中肝纖維化的代謝驅動機制，圍繞線粒體蛋白酶 LONP1 如何通過調控 DHODH 降解和乳清酸代謝，影響肝細胞與肝星狀細胞之間的代謝串擾，并最終推動 MASH 相關肝纖維化展開系統研究。

MASH 是代謝功能障礙相關性脂肪性肝病進展中的關鍵階段，其病理特征包括脂肪變性、炎癥損傷和纖維化加速。肝纖維化不僅是疾病進展的重要標志，也是影響患者長期預后的核心因素之一。然而，目前針對 MASH 相關肝纖維化的有效治療手段仍然有限，尤其是驅動肝星狀細胞持續活化的代謝信號及其來源仍有待深入闡明。

本研究發現，MASH 患者和小鼠肝臟中線粒體蛋白酶 LONP1 表達顯著降低。進一步通過肝細胞特異性 Lonp1 敲除模型，研究者證實 LONP1 缺失可導致肝損傷和纖維化加重，并伴隨肝星狀細胞活化增強。多組學分析顯示，LONP1 缺失后肝臟代謝譜發生顯著重塑，其中乳清酸水平明顯升高，提示其可能是連接肝細胞線粒體穩態紊亂與纖維化進展的關鍵代謝物。

機制研究進一步揭示，LONP1 可直接結合并以 ATP 依賴方式降解二氫乳清酸脫氫酶 DHODH。DHODH 是嘧啶合成通路中的關鍵酶，參與乳清酸生成。當 LONP1 表達下降時，DHODH 蛋白異常積累，導致乳清酸過量生成。升高的乳清酸可被肝星狀細胞攝取，并促進其增殖和活化，從而加速膠原沉積和肝纖維化進程。

在下游機制方面，研究顯示乳清酸可增強轉錄因子 ATF3 的核定位和轉錄活性，進而促進 ACTA2、COL1A1、COL6A1 和 TIMP1 等纖維化相關基因表達。敲低 ATF3 后，乳清酸誘導的肝星狀細胞活化被明顯削弱，說明乳清酸推動纖維化的作用依賴 ATF3 介導的轉錄調控。

更重要的是，研究者通過遺傳和藥物干預進一步驗證了這一通路的治療潛力。肝細胞特異性過表達 LONP1 可降低 DHODH 和乳清酸水平，抑制肝星狀細胞活化，并顯著緩解 MASH 小鼠肝纖維化。LONP1 激活劑 84-B10 和 DHODH 抑制劑 brequinar 也均可降低乳清酸水平并改善實驗性肝纖維化。人群樣本分析進一步顯示，MASH 及 MASH 纖維化患者中 LONP1 水平降低、DHODH 和乳清酸水平升高，且乳清酸水平與纖維化基因表達和纖維化評分呈正相關。

總體而言，該研究提出了一條新的 MASH 肝纖維化代謝驅動軸：LONP1 下降 → DHODH 積累 → 乳清酸過量生成 → ATF3 介導肝星狀細胞活化 → 肝纖維化加重。這一發現不僅拓展了人們對線粒體蛋白質穩態與肝纖維化關系的認識，也提示靶向 LONP1-DHODH-乳清酸軸可能成為干預 MASH 相關肝纖維化的新策略。

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【摘要】

背景與目的：
識別驅動代謝功能障礙相關性脂肪性肝炎（MASH）中肝纖維化發生發展的代謝靶點，對于開發有效的預防性治療策略至關重要。然而，MASH 中發生失調的代謝通路及其潛在分子機制仍不清楚。Lon 肽酶 1（LONP1）是一種線粒體蛋白酶，在維持線粒體蛋白質量監控以及執行高度調控的蛋白水解反應中發揮關鍵作用。本研究旨在探索 LONP1 如何將蛋白水解監控與肝纖維化中的線粒體代謝重塑聯系起來。

方法：
本研究使用了小鼠肝纖維化模型、肝細胞特異性 Lonp1 敲除小鼠模型，以及來自 MASH 患者的肝活檢樣本。通過轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學分析，鑒定可能促進 MASH 誘導肝纖維化的潛在代謝物。

結果：
MASH 患者和 MASH 小鼠中的 LONP1 表達降低。肝細胞特異性 LONP1 缺失會導致二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）積累、乳清酸水平升高，并加重 MASH 誘導的纖維化。相反，過表達 LONP1 或使用 DHODH 抑制劑可降低乳清酸水平，并緩解小鼠 MASH 誘導的肝纖維化。機制上，LONP1 可通過 ATP 依賴方式選擇性降解 DHODH，從而降低乳清酸水平，并抑制 ATF3（激活轉錄因子 3）介導的肝星狀細胞活化。這些發現也在 MASH 患者中得到驗證：血漿乳清酸水平與肝臟 LONP1 水平呈負相關，并與纖維化相關基因表達和纖維化評分呈正相關。

結論：
本研究表明，LONP1-DHODH 相互作用調控乳清酸代謝，并可緩解 MASH 誘導的肝纖維化。

01

研究背景及科學問題

代謝功能障礙相關性脂肪性肝病（MASLD）是肝硬化發生的重要原因。代謝功能障礙相關性脂肪性肝炎（MASH）是 MASLD 更進展的階段，其特征包括壞死性炎癥、纖維化加速以及肝硬化和肝細胞癌風險升高。該疾病影響約 3%–6% 的成年人，且預計患病率還將進一步上升，使 MASH 成為一個日益嚴峻的全球健康問題。雖然已有多種藥物處于后期研發階段，但目前針對肝纖維化的有效治療仍然有限。鑒于 MASH 的病理生理過程復雜且異質性顯著，亟需更深入地理解驅動肝纖維化的分子機制。

肝星狀細胞（HSCs）在肝纖維化中發揮關鍵作用。在 MASH 中，受損肝細胞或免疫細胞釋放信號，導致 HSC 活化。活化的 HSC 表達 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）并合成膠原，從而導致細胞外基質積累和肝纖維化。MASH 誘導的纖維化涉及 HSC 與肝臟微環境中多種細胞成分之間的復雜相互作用，包括趨化因子、生長因子、活性氧以及代謝物。由于肝臟在全身代謝中處于核心地位，其微環境中含有廣泛的代謝物，其中一些會影響纖維化進展，例如乳酸和膽酸。研究表明，二者均可通過改變代謝重編程和轉錄因子活性，顯著影響 HSC 活化。然而，還有許多潛在代謝物尚未被充分探索。

Lon 肽酶 1（LONP1）是一種進化上保守的線粒體蛋白酶，具有 ATP 依賴性活性。作為線粒體蛋白降解的核心調節因子，LONP1 可降解線粒體基質中氧化或受損的蛋白。LONP1 還在機體生長、發育和衰老中發揮重要作用，人類 LONP1 基因突變與 CODAS 綜合征相關。在腫瘤細胞中，LONP1 影響細胞凋亡、線粒體能量代謝和氧化應激，并可促進腫瘤進展。既往研究顯示，LONP1 調控的底物蛋白周轉失衡會導致肌肉功能障礙，且由 LONP1 介導的線粒體代謝微環境會影響脂肪細胞身份。然而，線粒體蛋白水解酶以及受調控的線粒體蛋白水解是否與 MASH 誘導的肝纖維化存在機制聯系，目前仍不清楚。

我們假設，肝細胞中的 LONP1 通過尚未明確的代謝物介導途徑調控 MASH 誘導的肝纖維化。本研究利用肝細胞特異性 Lonp1 敲除小鼠，發現 LONP1 在控制乳清酸（OA）代謝中發揮關鍵作用。在 MASH 小鼠模型中，肝臟缺失 LONP1 會導致 DHODH 蛋白周轉受損和 OA 代謝紊亂，從而增強肝纖維化。相反，肝細胞特異性過表達 LONP1 或使用 DHODH 抑制劑可保護 MASH 小鼠免受肝纖維化影響。機制上，LONP1 可選擇性介導 DHODH 周轉，從而維持較低水平的 OA；低水平 OA 進一步抑制 ATF3 介導的 HSC 增殖和活化，進而預防肝纖維化。本研究揭示了線粒體蛋白水解調控在塑造 HSC 狀態中的重要性，并為肝細胞與 HSC 之間通過線粒體蛋白酶調控 OA 代謝進行串擾提供了新的認識。這些結果提示，LONP1 介導的 DHODH 周轉可能是 MASH 誘導肝纖維化的潛在治療靶點。

02

重要發現及亮點

肝細胞 LONP1 表達在 MASH 患者和小鼠中降低

對 MASH 患者以及喂食西方飲食（WD）28 周小鼠的肝組織進行組織學檢查，結果顯示明顯的肝脂肪變性、炎癥和顯著肝損傷。在 MASH 患者和小鼠的肝組織中均觀察到膠原沉積增加所形成的纖維化區域。α-SMA 免疫組化分析顯示 HSC 明顯活化，定量逆轉錄 PCR 檢測也發現促纖維化標志物 COL1A1、TGF-β1、TIMP1 和 ACTA2 的 mRNA 水平升高。

線粒體蛋白酶是蛋白質量控制的第一道防線，可通過選擇性降解受損線粒體蛋白來維持線粒體功能和正常細胞代謝。與健康對照相比，MASH 患者肝臟中的 LONP1 mRNA 表達顯著降低；LONP1 免疫組化染色和免疫印跡進一步證實了這一結果。同樣，與對照小鼠相比，WD 喂養小鼠肝組織中的 Lonp1 mRNA 和蛋白水平均顯著降低。有趣的是，病例氨酸水解蛋白酶 P（CLPP）在 MASH 患者和小鼠肝臟中也降低，這與既往研究結果一致。

為了進一步探索線粒體蛋白酶與肝纖維化之間的關系，研究者重新分析了來自肝纖維化患者和健康個體的單細胞 RNA 測序數據集，重點評估肝細胞中 LONP1 和 CLPP 的表達。細胞群經重新分類后得到 8 個不同細胞簇。與健康對照相比，纖維化患者肝細胞中的 LONP1 和 CLPP 表達顯著降低。既往研究已顯示 CLPP 缺失可誘發脂肪性肝炎，并增強高熱量飲食誘導的脂肪性肝炎；而 MASH 患者或小鼠肝臟中 LONP1 降低此前尚未被報道。此外，通過單核 RNA 測序、免疫印跡和免疫熒光分析，研究進一步證實 MASH 中肝細胞 LONP1 表達降低。

圖 1. MASH 患者和小鼠肝細胞中的 LONP1 表達降低。
(A) 健康對照和 MASH 患者肝組織切片中 Masson、天狼星紅和 α-SMA 免疫組化染色代表圖。
(B) 普通飲食或西方飲食喂養 28 周小鼠肝組織中 Masson、天狼星紅和 α-SMA 免疫組化染色代表圖，顯示纖維化病灶。
(C) 人和小鼠肝組織中纖維化相關基因表達的 qPCR 分析。
(D、G) 人和小鼠肝組織中 LONP1 表達的 qPCR 分析。
(E、H) 健康對照、MASH 患者以及普通飲食和西方飲食小鼠肝切片中 LONP1 免疫組化染色代表圖。
(F、I) 人和小鼠肝組織中 LONP1 蛋白水平的 Western blot 分析。
(J) 單細胞 RNA 測序數據分析顯示 LONP1 在不同細胞簇中的表達。
(K) 人肝組織中 LONP1 與肝細胞標志物 HNF4α 的免疫熒光染色。
(L) 從普通飲食和西方飲食小鼠分離的原代肝細胞中 LONP1 的 Western blot 分析。
(M) 小鼠肝組織中 LONP1 與 HNF4α 的免疫熒光染色。數據以均值 ± 標準誤表示。

肝細胞特異性 LONP1 缺失可誘導小鼠肝纖維化

研究首先在非 MASH 肝纖維化動物模型中考察 LONP1 下調與肝纖維化的關系。該模型通過連續 8 周腹腔注射四氯化碳（CCl4）建立。與對照小鼠相比，CCl4 處理小鼠出現顯著炎癥細胞浸潤，血清丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶和總膽汁酸水平升高，提示顯著肝損傷。Masson 染色、天狼星紅染色、Col1a1 免疫組化和 α-SMA 免疫熒光均顯示 CCl4 處理小鼠肝臟膠原沉積和纖維化增加。纖維化相關基因表達也在 CCl4 處理小鼠肝臟中上調，但肝臟 LONP1 蛋白水平沒有顯著變化。這些結果提示，非 MASH 肝纖維化并不伴隨 LONP1 下調。

為評估肝細胞中 LONP1 表達降低是否促進肝纖維化，研究者將 floxed Lonp1 小鼠與 Alb-Cre 轉基因小鼠雜交，建立肝細胞特異性 Lonp1 敲除小鼠模型。6 周齡雄性敲除小鼠肝臟中的 LONP1 蛋白顯著降低。與野生型同窩對照相比，敲除小鼠體重下降，但肝重/體重比升高。此外，敲除小鼠的空腹血糖、非空腹血糖以及血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平均顯著降低。相反，血清丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶和總膽汁酸水平顯著升高。

油紅 O 染色顯示敲除小鼠肝臟中存在大量脂質積累。H&E 染色顯示明顯肝損傷；Masson 染色、天狼星紅染色和 α-SMA 免疫熒光則表明肝細胞特異性 LONP1 缺失與進行性纖維化和 HSC 活化相關。隨后，研究者對敲除小鼠和野生型小鼠肝臟 mRNA 進行 RNA 測序分析。以 2 倍變化和顯著性閾值為標準，共鑒定出 2,763 個差異表達基因，其中 1,586 個上調，1,177 個下調。基因集富集分析顯示，與膠原形成、膠原生物合成和膠原代謝相關的基因在敲除小鼠肝臟中富集。熱圖顯示多種肝纖維化相關基因顯著上調，其中 5 個代表性標志物經 qRT-PCR 驗證。這些結果共同提示，肝細胞中 LONP1 缺失可促進肝纖維化，而肝纖維化本身并不會誘導 LONP1 下調。

圖 2. 肝細胞特異性 LONP1 缺失導致小鼠肝纖維化。
(A) 敲除小鼠構建示意圖。
(B) 6 周齡野生型和肝細胞特異性 Lonp1 敲除小鼠肝臟 LONP1 蛋白水平的 Western blot 分析。
(C) 野生型和敲除小鼠血清 ALT、AST 和總膽汁酸水平。
(D) 野生型和敲除小鼠肝組織 H&E 染色代表圖。
(E) 野生型和敲除小鼠肝組織天狼星紅、Masson 和 α-SMA 染色代表圖。
(F) RNA 測序數據火山圖，展示敲除小鼠與野生型小鼠肝臟差異表達基因。
(G) 基因集富集分析顯示敲除小鼠肝臟中富集的通路。
(H) 差異表達的纖維化相關基因熱圖。
(I) 肝組織中代表性纖維化相關基因的 qPCR 驗證。數據以均值 ± 標準誤表示。

肝細胞特異性 LONP1 缺失導致肝臟乳清酸過量生成

為探究 LONP1 缺失促進肝纖維化的代謝機制，研究者對敲除小鼠和野生型小鼠肝樣本進行了非靶向代謝組學分析。置換檢驗顯示兩組之間存在明顯不同的代謝譜，共鑒定出 690 種代謝物。以 1.5 倍變化和顯著性閾值為標準，敲除小鼠肝臟中有 195 種代謝物上調，173 種代謝物下調。分析表明，LONP1 缺失廣泛影響氨基酸、脂質和碳水化合物代謝。對顯著改變代謝物進行 KEGG 通路富集分析發現，其顯著富集于中心碳代謝相關通路，包括三羧酸循環、線粒體電子傳遞鏈以及精氨酸和脯氨酸代謝。

為了進一步鑒定參與肝纖維化進展的關鍵代謝物，研究者對敲除小鼠和野生型小鼠肝組織進行了中心碳代謝靶向代謝組學分析。共鑒定出 49 種差異代謝物，其中嘧啶合成和三羧酸循環相關代謝物水平升高，而糖酵解相關代謝物水平降低。在敲除小鼠肝臟中升幅最大的 6 種代謝物中，乳清酸這一嘧啶代謝關鍵中間體的增加最為明顯。此外，敲除小鼠肝組織表現出嘧啶代謝紊亂。與這些結果一致，WD 喂養小鼠的肝臟和血清乳清酸水平均顯著升高，提示 LONP1 缺失會導致肝細胞代謝紊亂，其中包括乳清酸代謝的顯著改變。

圖 3. LONP1 缺失小鼠、MASH 患者和 WD 喂養小鼠中乳清酸水平升高。
(A) 野生型和敲除小鼠肝組織非靶向代謝組學分析的置換檢驗結果。
(B) 火山圖顯示野生型與敲除小鼠之間代謝物水平的相對變化。
(C) 非靶向代謝組學中改變代謝物的 KEGG 通路富集分析。
(D) 肝組織靶向代謝組學分析，顯示糖酵解、三羧酸循環和嘧啶代謝改變。
(E) 敲除小鼠肝臟中升幅最顯著的 6 種代謝物濃度。
(F) 嘧啶和核苷酸代謝相關代謝物定量。
(G) 普通飲食和 WD 喂養小鼠血清乳清酸濃度。
(H) 普通飲食和 WD 喂養小鼠肝臟乳清酸濃度。數據以均值 ± 標準誤表示。

LONP1 靶向降解 DHODH 并抑制乳清酸過量生成

研究者進一步通過系統性蛋白質組學分析，探討 LONP1 對乳清酸代謝的調控作用。在敲除小鼠和野生型小鼠肝組織中共檢測到 6,533 種蛋白；以 1.5 倍變化和顯著性閾值為標準，共有 1,841 種蛋白差異表達，其中 999 種上調，842 種下調。對上調蛋白進行 KEGG 富集分析發現，嘧啶和核苷酸代謝位列前 20 個富集通路之一，與代謝組學結果一致。熱圖顯示，嘧啶和核苷酸代謝相關蛋白顯著改變，其中包括線粒體 DHODH，這是負責乳清酸生物合成的關鍵酶，并且顯著上調。

免疫印跡顯示，敲除小鼠肝臟中 DHODH 明顯積累，但 Dhodh mRNA 水平無顯著變化。隨后，研究者將表達 Cre 的腺病毒或對照載體轉導至 Lonp1f/f 原代小鼠肝細胞中，發現 Cre 表達細胞中 DHODH 積累，而對照載體組無此現象。通過 HEK293T 細胞中的環己酰亞胺追蹤實驗，研究者進一步檢測 LONP1 調控 DHODH 蛋白穩定性的能力。此外，與對照組相比，過表達 LONP1 的原代小鼠肝細胞中 DHODH 蛋白水平降低。這些結果提示，DHODH 可能是 LONP1 降解的底物。

隨后，研究者通過一系列共免疫沉淀實驗評估 LONP1 與 DHODH 的相互作用。首先，將 Flag-LONP1 和 HA-DHODH 表達載體共同轉染至 HEK293T 細胞后，使用抗 HA 抗體可共沉淀 LONP1；以 LONP1 作為免疫沉淀靶標時，也可反向拉下 DHODH。其次，肝組織中的共免疫沉淀實驗顯示 LONP1 與 DHODH 存在物理相互作用。第三，GST pull-down 實驗證實純化的 LONP1 與 DHODH 蛋白可直接相互作用。此外，原代小鼠肝細胞免疫熒光標記顯示 LONP1 與 DHODH 在線粒體中共定位。這些結果提示，LONP1 可直接與 DHODH 相互作用。

為確定 LONP1 中負責結合 DHODH 的結構域，研究者分別表達 LONP1 的 N 端結構域、ATPase 結構域和蛋白水解結構域。結果顯示，LONP1 的 N 端結構域和蛋白水解結構域均可與 DHODH 強烈相互作用，而 ATPase 結構域不能。進一步的肽酶和蛋白酶實驗中，重組 LONP1 與 DHODH 蛋白在有或無 ATP 以及不同 ATP 濃度下共同孵育。結果顯示，在存在 LONP1 的情況下，DHODH 蛋白水平隨 ATP 濃度升高而降低，提示 DHODH 可被 LONP1 以 ATP 依賴方式直接降解。

圖 4. DHODH 是 LONP1 的底物，并可被 LONP1 降解。
(A) 蛋白質組學分析實驗設計示意圖。
(B) KEGG 分析顯示 LONP1 缺失肝臟中上調蛋白富集的前 20 條通路。
(C) 熱圖顯示 KEGG 富集分析中核酸代謝通路內差異表達蛋白。
(D) 指定基因型小鼠肝組織中 LONP1 和 DHODH 蛋白水平的 Western blot 分析。
(E) 指定基因型小鼠肝組織中 Dhodh mRNA 水平。
(F) HEK293T 細胞經環己酰亞胺處理后 DHODH 蛋白穩定性檢測。
(G) HEK293T 細胞中 LONP1 與 DHODH 相互作用的共免疫沉淀實驗。
(H) 小鼠肝組織中 LONP1 與 DHODH 相互作用的共免疫沉淀驗證。
(I) GST pull-down 實驗證明純化重組 LONP1 與 DHODH 蛋白直接相互作用。
(J) 原代小鼠肝細胞經 MG132 處理后，LONP1 與 DHODH 共定位的免疫熒光圖像。
(K) 體外蛋白酶實驗：重組 DHODH 與不同量 LONP1 在有或無 ATP 條件下孵育，并通過免疫印跡分析 DHODH 降解。
(L) DHODH 與 LONP1 在不同 ATP 濃度下孵育，以評估蛋白水解的 ATP 依賴性。數據以均值 ± 標準誤表示。

乳清酸促進 HSC 活化和增殖

為評估敲除小鼠中升高的代謝物對肝纖維化的潛在影響，研究者使用不同濃度的乳清酸、甘油酸、順烏頭酸、檸檬酸、吲哚乙酸和氧代己二酸處理人 LX-2 細胞。有趣的是，乳清酸可劑量依賴性地刺激 HSC 增殖，而其他 5 種代謝物無此作用；Cy5 標記的乳清酸也可被原代 HSC 攝取。α-SMA 免疫熒光分析顯示，乳清酸可有效激活小鼠原代 HSC 和 LX-2 細胞，并且兩種細胞中 α-SMA 水平均在乳清酸刺激后顯著升高。研究還發現，乳清酸可增強 LX-2 細胞對 TGF-β1 刺激的反應。這些數據提示，乳清酸可促進 HSC 增殖和活化。

為了探究肝細胞來源乳清酸是否通過肝細胞-HSC 串擾形成促纖維化微環境，研究者首先檢測了 LONP1 缺失原代小鼠肝細胞對原代 HSC 的影響。研究者從 Lonp1f/f 小鼠原代肝細胞中制備條件培養基，這些肝細胞分別經 Ad-Vector 或 Ad-Cre 處理，再將小鼠原代 HSC 暴露于這些條件培養基中。質譜分析顯示，Ad-Cre 組條件培養基中的乳清酸水平高于 Ad-Vector 組。此外，CM-Ad-Cre 組 HSC 的增殖能力及 HSC 活化標志物 COL1A1、ACTA2 和 TIMP1 表達均更高。α-SMA 免疫熒光和免疫印跡顯示，CM-Ad-Cre 組中 HSC 向 α-SMA 陽性肌成纖維細胞分化增強。使用 Lonp1-/- 肝細胞與原代 HSC 共培養體系進一步證實了這些發現。

圖 5. 乳清酸促進 HSC 活化和增殖。
(A) CCK8 實驗評估 LX-2 細胞經乳清酸處理 48 小時后的活力。
(B) EdU 染色顯示小鼠原代 HSC 經不同濃度乳清酸處理 48 小時后的 DNA 復制情況。
(C、D) 小鼠原代 HSC 經乳清酸處理 24 小時后，通過免疫熒光和 Western blot 檢測 α-SMA 表達。
(E、F) LX-2 細胞經乳清酸處理 24 小時后，通過免疫熒光和 Western blot 檢測 α-SMA 表達。
(G) 條件培養基實驗示意圖：收集 Ad-Vector 或 Ad-Cre 感染肝細胞的條件培養基，并用于處理小鼠原代 HSC。
(H) 不同條件培養基中的乳清酸濃度。
(I) EdU 染色評估條件培養基處理后小鼠原代 HSC 的增殖能力。
(J–L) 小鼠原代 HSC 經條件培養基處理 24 小時后，檢測 Col1a1、Acta2 和 Timp1 mRNA 水平，以及 α-SMA 蛋白水平。
(M) 共培養系統示意圖。
(N、O) α-SMA 免疫熒光和 Western blot 結果。數據以均值 ± 標準誤表示。

乳清酸促進肝纖維化依賴 ATF3

研究者建立肝脂肪變性和纖維化小鼠模型，以研究乳清酸對 MASH 誘導肝纖維化的體內作用。小鼠接受 12 周高脂飲食并聯合 2 周 CCl4 處理，最后 2 周添加或不添加 5% 乳清酸。肝切片 H&E 染色確認高脂飲食小鼠出現明顯脂肪變性和炎癥。Ki67 與 Desmin 共染色顯示，與對照小鼠相比，乳清酸處理小鼠肝組織中增殖性 HSC 更豐富。免疫熒光和天狼星紅染色顯示，乳清酸誘導的 MASH 小鼠中 α-SMA 表達增加，提示纖維化更嚴重。此外，乳清酸處理小鼠肝臟中促纖維化基因表達顯著上調�？傮w而言，這些結果表明，乳清酸補充會加重高脂飲食小鼠的肝纖維化。

為闡明乳清酸調控 HSC 增殖和活化的分子機制，研究者對接受 HFD/CCl4 處理且有或無 5% 乳清酸補充的小鼠肝組織進行了 RNA 測序分析。以 1.5 倍變化和顯著性閾值為標準，共鑒定出 701 個差異表達基因，其中 288 個上調，413 個下調。乳清酸處理顯著增加了與細胞基質黏附相關基因的表達。在上調的轉錄因子中，ATF3 被鑒定出來；ATF3 已被報道可促進纖維化相關基因表達，這與本研究結果一致。此外，乳清酸和 CM-Cre 均可增加 ATF3 的核定位，但不影響其 mRNA 水平；熒光素酶報告實驗顯示，乳清酸處理可增強 ATF3 的轉錄活性。研究者隨后利用既有 CUT&Tag 數據鑒定 ATF3 調控的纖維化相關基因，包括 ACTA2、COL6A1、TIMP1 和 COL1A1，提示 ATF3 可協調這些基因的表達。染色質免疫沉淀結合 qRT-PCR 進一步顯示，與非特異性 IgG 抗體相比，抗 ATF3 抗體對上述 4 個基因啟動子片段具有顯著更高的結合能力。

隨后，研究者通過 leti-shAtf3 敲低原代小鼠 HSC 中的 ATF3，考察 ATF3 在乳清酸誘導 HSC 活化中的作用。ATF3 敲低可消除乳清酸誘導的纖維化相關基因表達效應。α-SMA 免疫熒光顯示，ATF3 敲低也可抑制乳清酸和 CM-Ad-Cre 對原代小鼠 HSC 的促纖維化作用。這些發現表明，乳清酸誘導的 HSC 活化依賴轉錄因子 ATF3。

圖 6. 乳清酸以 ATF3 依賴方式促進 HSC 活化。
(A) 原代 HSC 經乳清酸處理 24 小時后 ATF3 的免疫熒光染色。
(B) 原代 HSC 經乳清酸或條件培養基處理 24 小時后 Atf3 mRNA 表達。
(C) 將 Atf3 啟動子熒光素酶報告載體轉染 HEK293T 細胞后，乳清酸處理 24 小時并檢測熒光素酶活性。
(D) ACTA2 和 COL6A1 位點可視化結果，顯示 ATF3 協調纖維化基因表達。
(E) ChIP-qPCR 分析 ATF3 和 IgG 在 Acta2、Col6a1、Timp1 和 Col1a1 啟動子片段上的占據情況。
(F) 不同處理組原代 HSC 中 Atf3 mRNA 水平。
(G) 不同處理組原代 HSC 中纖維化相關基因 Acta2、Col1a1、Col6a1 和 Timp1 的 mRNA 水平。
(H) 原代 HSC 經慢病毒感染 24 小時后，再接受乳清酸或條件培養基處理 24 小時，通過免疫熒光評估 α-SMA 表達。數據以均值 ± 標準誤表示。

肝細胞特異性 LONP1 消融加重小鼠 MASH 誘導的肝纖維化

研究者進一步考察肝臟中 LONP1 耗竭是否會加重 MASH 誘導的纖維化。首先，在 CKO 小鼠和野生型小鼠中通過 16 周高脂飲食誘導脂肪性肝炎。在 LONP1 耗竭的 CKO 小鼠肝臟中，DHODH 蛋白水平略有增加；質譜分析顯示，這些小鼠血漿和肝臟中的乳清酸水平均顯著升高。共免疫染色同樣顯示 HSC 增殖和活化增加。qRT-PCR 顯示 CKO 小鼠肝臟中 Atf3 mRNA 水平和纖維化基因表達上調。Masson 和天狼星紅染色顯示 CKO 小鼠肝臟膠原沉積增加。

為了評估出生后肝臟 LONP1 耗竭是否促進 MASH 誘導的肝纖維化，研究者在高脂飲食喂養的 Lonp1fl/fl 小鼠中，通過腺相關病毒 8 介導的 TBG-Cre 遞送誘導急性 LONP1 刪除。與注射 AAV8-TBG-GFP 的 Lonp1fl/fl 小鼠相比，AAV8-TBG-Cre 小鼠的 LONP1 蛋白水平顯著降低，導致 DHODH 水平升高，并伴隨肝組織和血清乳清酸水平顯著升高。出生后 Lonp1 消融還導致 HSC 增殖和活化增加，但不影響 Atf3 mRNA 水平。此外，qRT-PCR 顯示 Lonp1 消融顯著增加纖維化相關基因 mRNA 水平。Masson 和天狼星紅染色進一步證明，Lonp1 消融增加 MASH 小鼠肝臟膠原沉積。因此，出生后肝臟 LONP1 缺失可促進 MASH 誘導的肝纖維化。

抑制肝臟乳清酸過量生成可改善小鼠 MASH 誘導的肝纖維化

研究者通過向高脂/高果糖飲食喂養小鼠靜脈注射肝細胞特異性表達 LONP1 的 AAV8-TBG 或對照 AAV8-TBG-GFP，檢驗 LONP1 過表達是否可通過降解 DHODH 并抑制肝臟乳清酸過量生成，從而保護小鼠免受 MASH 背景下肝纖維化影響。免疫印跡顯示，LONP1 過表達后 DHODH 水平顯著降低，并伴隨肝組織和血清乳清酸水平均明顯下降。共免疫染色顯示，LONP1 過表達抑制 HSC 增殖和活化，同時纖維化基因 mRNA 水平顯著下降，但 Atf3 mRNA 水平無變化。與注射 AAV-GFP 的小鼠相比，LONP1 過表達的高脂/高果糖飲食小鼠膠原沉積顯著減輕。這些結果提示，AAV 介導的肝細胞 LONP1 過表達可保護小鼠免受高脂/高果糖飲食誘導的肝纖維化。

基于上述發現，研究者進一步探索肝纖維化治療的潛在策略，檢測已知 LONP1 激活劑 84-B10 在蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導的肝纖維化小鼠模型中的作用。小鼠接受蛋氨酸-膽堿缺乏飲食 5 周，并在連續 4 周內隔日腹腔注射 84-B10。結果顯示，84-B10 可增加 LONP1 水平，并降低 DHODH 和血清乳清酸水平。84-B10 還減少 HSC 增殖和活化，并降低該飲食誘導的肝纖維化，而不影響 Atf3 mRNA 水平。由于 WD 模型更接近人類 MASH 的代謝特征，研究者進一步評估 84-B10 對 WD 誘導肝纖維化的抗纖維化作用。84-B10 處理顯著減輕肝纖維化，同時伴隨肝臟 LONP1 表達增加以及 DHODH 表達和乳清酸水平降低。這些發現表明，84-B10 具有緩解小鼠 MASH 誘導肝纖維化的治療潛力。

為了研究 DHODH 抑制是否通過降低乳清酸水平緩解 MASH 誘導的肝纖維化，研究者使用強效 DHODH 抑制劑 brequinar（BRQ）處理 MASH 小鼠。小鼠接受 28 周高脂飲食，并在最后 4 周隔日腹腔注射 BRQ。組織學分析顯示，BRQ 對肝臟脂質積累或肝細胞氣球樣變無顯著影響，但血清和肝組織中的乳清酸水平均顯著低于對照組。免疫熒光研究顯示，BRQ 給藥抑制 HSC 增殖和活化，減少膠原沉積，并改善纖維化。免疫印跡和 qRT-PCR 均顯示，BRQ 處理小鼠中纖維化相關蛋白和基因表達顯著降低。這些發現表明，BRQ 可通過降低乳清酸水平有效緩解高脂飲食誘導的 MASH 肝纖維化。

研究者進一步在人類樣本中考察 LONP1 調控乳清酸代謝并減輕 MASH 誘導肝纖維化的作用。對 78 例患者肝樣本的分析顯示，LONP1 mRNA 表達與關鍵纖維化相關基因 ACTA2、COL1A1 和 TIMP1 呈顯著負相關。Lonp1 mRNA 水平還與 NAFLD 活動度評分和纖維化評分呈負相關。纖維化更嚴重的患者表現出更低的肝臟 LONP1 表達和更高的 DHODH 表達。肝臟和血清乳清酸水平在 MASL 患者中相對不變，但在 MASH 和 MASH 纖維化患者中明顯升高。血清乳清酸水平與纖維化相關基因表達和纖維化評分呈顯著正相關。值得注意的是，肝臟乳清酸水平也與纖維化基因表達和纖維化評分呈正相關。綜上，這些發現提示 LONP1 是乳清酸代謝的負調控因子，抑制肝臟乳清酸過量生成可改善 MASH 誘導的肝纖維化。

圖 7. LONP1-DHODH-乳清酸軸調控小鼠 MASH 誘導的肝纖維化。
(A) 實驗設計示意圖：5 周齡雄性 Lonp1f/f 小鼠接受 28 周高脂飲食誘導肝纖維化，并在最后 10 周注射 AAV-Gfp 或 AAV-Cre。
(B) 指定小鼠肝組織中 LONP1 和 DHODH 蛋白水平的 Western blot 分析和定量。
(C) 血清和肝組織中乳清酸濃度。
(D) Ki67 和 Desmin 免疫熒光染色，用于評估 HSC 增殖。
(E) α-SMA 免疫熒光染色，用于評估 HSC 活化。
(F) 指定組別肝組織中 Atf3 mRNA 表達水平。
(G) 指定小鼠肝組織中纖維化相關基因的 qPCR 分析。
(H) 天狼星紅染色代表圖，顯示肝纖維化嚴重程度。
(I) 實驗設計示意圖：5 周齡雄性 C57BL/6 小鼠接受 28 周高脂/高果糖飲食誘導 MASH 肝纖維化，并在最后 10 周注射 AAV-Gfp 或 AAV-TBG-Lonp1。
(J) 肝組織中 LONP1 和 DHODH 蛋白水平的 Western blot 分析和定量。
(K) 血清和肝組織中乳清酸濃度。
(L) Ki67、Desmin 和 DAPI 免疫熒光染色，用于評估 HSC 增殖。
(M) α-SMA 和 DAPI 免疫熒光染色，用于評估 HSC 活化。
(N) 指定組別肝組織中 Atf3 mRNA 水平。
(O) 指定小鼠肝組織中纖維化相關基因的 qPCR 分析。
(P) 天狼星紅染色代表圖，顯示肝纖維化嚴重程度。數據以均值 ± 標準誤表示。

圖 8. LONP1-DHODH-乳清酸軸與人類 MASH 誘導的肝纖維化相關。
(A、B) 肝組織樣本中 LONP1 基因表達與纖維化相關基因、NAFLD 活動度評分和纖維化評分之間的相關性分析。
(C、D) 正常個體以及 MASL、MASH 或 MASH 纖維化患者肝組織中 LONP1 和 DHODH 免疫組化、H&E 染色和天狼星紅染色代表圖及定量。
(E) LONP1 與 DHODH 蛋白水平之間的相關性分析。
(F) 指定組別肝組織中 LONP1 和 DHODH 的 Western blot 分析。
(G) 指定患者血清和肝組織中乳清酸濃度。
(H、I) 血清乳清酸水平與纖維化相關基因表達、NAFLD 活動度評分和纖維化評分之間的相關性。
(J、K) 肝臟乳清酸水平與纖維化相關基因表達、NAFLD 活動度評分和纖維化評分之間的相關性。數據以均值 ± 標準誤表示。

【Citation】:Xu D, Zhang Z, Zhu Z, Wei W, Bai Y, Wang W, et al. Decreased LONP1 expression exacerbates MASH-induced liver fibrosis via elevated orotic acid levels.Journal of Hepatology.2026;84:165–180.

【貢獻】★★★★★

綜上，本研究將乳清酸代謝確定為 MASH 中一個有前景的代謝靶點，并揭示了乳清酸過量生成通過細胞間信號傳導驅動肝纖維化的新機制。靶向調控乳清酸或肝細胞 LONP1，可能成為預防 MASH 誘導肝纖維化的新型治療策略。進一步探索 LONP1 如何將蛋白水解監控與乳清酸代謝聯系起來，可能為理解 MASH 誘導肝纖維化的發病機制提供新的見解。

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