在原核微生物細(xì)胞工廠內(nèi)，我們是否能在不改變遺傳密碼 DNA 信息的前提下，只用一個(gè) RNA 工具就能同時(shí)調(diào)節(jié)多條生產(chǎn)線（代謝通路）的 “ 加速、剎車和拆除 ” 呢？

近日，上海交通大學(xué)童垚俊團(tuán)隊(duì)在 Nature Biotechnology 雜志在線發(fā)表題為 Programmable, multiplexed and orthogonal gene control in bacteria with attenuated Cas13d systems 的研究論文，提出“活性-特異性-毒性”平衡策略，首次為原核生物開(kāi)發(fā)了基于單一Cas13d效應(yīng)子的多功能RNA調(diào)控平臺(tái)SONAR。該系統(tǒng)通過(guò)設(shè)計(jì) 構(gòu)建減活的 Cas13d 變體、 crRNA 5′ 端錯(cuò)配設(shè)計(jì)以及 IF3 的融合，將 RNA 切割、 RNA 結(jié)合和翻譯調(diào)控功能重新組合，使同一個(gè) Cas13d 系統(tǒng)能夠根據(jù) crRNA 設(shè)計(jì)分別執(zhí)行轉(zhuǎn)錄本降解、翻譯抑制和翻譯激活任務(wù)。NatureBiotechnology雜志同期還以 Research Briefing 的形式對(duì)該工作進(jìn)行了題為Revolutionizing biotechnology advances natural products discovery and industrial processing的報(bào)道。

生物制造是合成生物學(xué)走向產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的重要方向。 微生物細(xì)胞工廠 則是生物制造的芯片，高效的細(xì)胞工廠 往往需要同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè) 代謝 節(jié)點(diǎn)，并在生長(zhǎng)、前體供應(yīng)和產(chǎn)物合成之間 達(dá)到 平衡。在細(xì)菌中，大量基因以操縱子形式表達(dá)，傳統(tǒng) DNA 靶向 CRISPR 工具通常難以實(shí)現(xiàn)操縱子內(nèi)單個(gè)基因的精細(xì)調(diào)控。 Cas13 作為 RNA 靶向效應(yīng)蛋白為原核 RNA 水平調(diào)控提供了新思路，但其在細(xì)菌中的應(yīng)用長(zhǎng)期受到旁側(cè)切割帶來(lái)的細(xì)胞毒性限制。本研究發(fā)現(xiàn) Cas13d 的切割特異性與其細(xì)胞內(nèi)有效酶活性密切相關(guān)。過(guò)高的 RNase 活性容易帶來(lái)旁側(cè) RNA 擾動(dòng)和宿主生長(zhǎng)抑制，而適度降低活性則有助于在靶標(biāo)敲低和細(xì)胞負(fù)擔(dān)之間取得平衡。基于此，團(tuán)隊(duì)提出 “ 活性 - 特異性 - 毒性 ” 平衡假說(shuō)，通過(guò)截短 RNase 活性中心附近柔性區(qū)域， 成功構(gòu)建了一系列具有梯度活性，同時(shí)又保持特異性和降低毒性的 Cas13d 變體。

進(jìn)一步，通過(guò)在crRNA間隔序列5′端引入連續(xù)錯(cuò)配，實(shí)現(xiàn)了Cas13d的RNA切割功能與RNA結(jié)合功能的部分解耦。完全匹配的 crRNA 可引導(dǎo)減活 Cas13d 降解多順?lè)醋?mRNA ，而含 7 個(gè) 5′ 端錯(cuò)配的 PM7crRNA 則在基本關(guān)閉切割活性的同時(shí)保留 RNA 結(jié)合能力，從而實(shí)現(xiàn)翻譯起始區(qū)域的單基因翻譯抑制。為進(jìn)一步擴(kuò)展功能， 團(tuán)隊(duì) 將細(xì)菌翻譯起始因子 IF3 融合至減活 Cas13d ，構(gòu)建了 atnCas13d-IF3 ，使其能夠在 PM7crRNA 引導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)翻譯水平激活。由此 創(chuàng)制SONAR(Synthetic O rthogonal N ucleic acid A ctivation and R epression) 系統(tǒng) ，僅通過(guò)crRNA設(shè)計(jì)，即可在同一Cas效應(yīng)子框架下實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本降解、翻譯抑制和翻譯激活三種調(diào)控模式。

圖 1. 基于 atnCas13d-IF3 的多功能原核基因表達(dá)調(diào)控平臺(tái) SONAR 。

在多熒光報(bào)告系統(tǒng)中， SONAR 能夠在同一細(xì)胞內(nèi)分別對(duì) 三個(gè)報(bào)告基因 實(shí)施翻譯抑制、翻譯激活和轉(zhuǎn)錄本降解，驗(yàn)證了其多功能、正交和多路調(diào)控能力。團(tuán)隊(duì)隨后將該系統(tǒng)應(yīng)用于大腸桿菌番茄紅素生物合成途徑優(yōu)化。通過(guò) 調(diào)節(jié)碳流分配 、前體供應(yīng)、競(jìng)爭(zhēng)支路和外源 crtEBI 合成模塊等多個(gè)節(jié)點(diǎn)， SONAR 重塑 了代謝通路 ， 在 3 L 發(fā)酵罐中 提升 番茄紅素 產(chǎn)量達(dá) 2.39 倍。

SONAR將Cas13d從單一RNA切割工具拓展為可編程、可組合的RNA層級(jí)調(diào)控系統(tǒng)，為操縱子內(nèi)單基因調(diào)節(jié)、多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄本降解和翻譯水平激活提供了統(tǒng)一解決方案。該平臺(tái)為細(xì)菌合成生物學(xué)提供了新的模塊化工具，也為微生物細(xì)胞工廠的快速優(yōu)化和動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控提供了新的技術(shù)路徑。

圖 2 . SONAR 概述 。

上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 、微生物代謝全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 童垚俊為本文通訊作者。 上海交通大學(xué) 博士研究生童圣坤為本文第一作者， 覃宇禧、孫雅倩、高 耀杰以及宋沐沂、方濤等也對(duì)本研究做出重要貢獻(xiàn)。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-026-03160-x

制版人： 十一

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