冬春季大口黑鱸潰瘍癥病原分離鑒定及病理形態學觀察

黃泊文1 ，向菲1，田子琦1，耿毅1 ，歐陽萍1，黃小麗2，陳德芳2，陽濤3

(1 四川農業大學 動物醫學院, 四川 成都 611130； 2 四川農業大學 動物科技學院, 四川 成都 611130；3 通威股份有限公司動物保健研究所, 四川 成都 610041)

流行性潰瘍綜合征( E p i z o o t i c u l c e r a t i v esyndrome, EUS) 是由侵入絲囊霉菌Aphanomycesinvadans 引起的一種季節性流行性疫病，最早于1971年在日本養殖的香魚中報道，目前已在澳大利亞、美國、印度等全球多個國家被發現，已知可感染160多種魚類，被世界動物衛生組織(WorldOrganization for Animal Health，WOAH) 列為法定申報疫病，我國將其列為二類動物疫病。該病以體表紅斑、鱗片掉落及皮膚壞死性潰瘍為臨床病變特征，組織學上肌纖維廣泛壞死和霉菌性肉芽腫為特征，主要流行于冬春兩季，發病后死亡率最高可達100%，給魚類健康造成嚴重威脅。常藕琴等2019年證實在珠江三角洲養殖的雜交鱧潰瘍病的病原為侵入絲囊霉菌，首次確認了流行性潰瘍綜合征對我國養殖鱧的危害，目前在我國鮮見其他養殖魚類感染發病的報道。

大口黑鱸Micropterus salmoides，又稱加州鱸，具有適應性強、生長快、易起捕、經濟價值高等優點，2019年被列為我國漁業主導養殖品種，在全國范圍內推廣， 養殖面積與產量快速提升，2020年全國產量已達62萬t，并有進一步發展的強勁勢頭。但隨著大口黑鱸養殖的快速發展，出現了如鰤諾卡菌病、運動性氣單胞菌病等細菌性疾病；車輪蟲病、斜管蟲病等寄生蟲病和大口黑鱸病毒病、大口黑鱸肝脾腫大病等病毒性疾病，制約大口黑鱸養殖業健康發展。近年來養殖大口黑鱸在冬春兩季發生一種以全身多處潰瘍為病變特征的疫病，給大口黑鱸養殖造成較為嚴重損失。本研究采集自然發病病例，采用病原學、病理學和分子生物學相結合的方法進行檢測，以期明確大口黑鱸冬春季潰瘍病的病因，為有效防控該病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2020年11月與2021年3月分別從四川眉山東坡區和洪雅縣兩地養殖場各采集患病明顯的6尾大口黑鱸，體質量均值(540.3±75.9)g。

1.2 病理剖檢與組織壓片觀察

按照常規方法進行病理剖檢，觀察外部與內臟器官的病理變化；取自然發病魚潰瘍灶，置于載玻片上，制做組織壓片，置于顯微鏡下觀察并記錄。

1.3 組織病理學觀察及基于侵入絲囊霉菌ITS基因的特異性PCR檢測

取潰瘍灶與正常交接處組織與各內臟臟器，用體積分數為10% 的福爾馬林固定，按常規石蠟切片的制作方法制作切片，進行蘇木精?伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining, HE)及基底膜六胺銀(Periodic acid-silver metheramine, PASM)染色，置于顯微鏡下觀察并記錄。用真菌DNA提取試劑盒(Omega bio-tek)提取患魚病變肌肉組織DNA，作為PCR反應的模板，參考OIE水產手冊侵入絲囊霉菌診斷規程，合成ITS11、ITS23引物，進行基于霉菌ITS基因的PCR檢測，預期擴增目的條帶550bp。PCR擴增產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 侵入絲囊霉菌的分離培養與形態學觀察

真菌分離培養參照OIE水產手冊侵入絲囊霉菌診斷規程，取潰瘍組織置于葡糖糖/蛋白胨(Glucose and peotone，GP)瓊脂中，25 ℃條件下培養并每日觀察，多次分離和純化直到培養物無污染。帶菌絲體的瓊脂塊置于葡糖糖/蛋白胨/酵母(Glucose peotone and yeast，GPY)肉湯中于20 ℃條件下孵育。依次在5個含滅菌池塘水的培養皿中洗滌培養物后，于滅菌池塘水20 ℃過夜。約12h后，在倒置顯微鏡下觀察。

1.5 分離侵入絲囊霉菌ITS基因序列分析

用真菌DNA提取試劑盒提取分離霉菌純培養物DNA，作為PCR反應的模板，使用“1.3”中引物序列及PCR程序擴增ITS部分基因，PCR擴增產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，目的條帶切膠回收，采用TA克隆法，克隆至pUCm-T載體送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序，ITS基因測序結果同GenBank數據庫中的序列進行相似性比對分析，用Mega11.0軟件采用鄰接法構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 病理剖檢及組織壓片觀察

患病大口黑鱸體表有形態不規則、大小不等的紅斑及明顯的體表潰瘍，皮膚肌肉壞死、溶解，出血呈灰白色或血紅色(圖1A)，潰瘍主要位于背部與體側，但部分病魚潰瘍發生在尾鰭或頭部，頭部潰瘍導致顱骨破損與穿孔(圖1B、1C)。鰓與內臟器官除肝色澤呈土黃色外，其他組織器官無明顯的眼觀病變。體表潰瘍組織壓片鏡檢，可見大量長桿形、絲狀、分支較少的菌絲體在肌肉中分布(圖1D)。

2.2 組織病理學及基于侵入絲囊霉菌ITS基因的特異性PCR檢測

鏡下觀察HE染色的潰瘍組織病理切片，皮膚表皮壞死、脫落；骨骼肌廣泛性變性、壞死，肌纖維橫紋消失，肌漿凝固，均質紅染，甚至斷裂、溶解；肌間隙與壞死的肌纖維內大量炎癥細胞浸潤(圖2A)。特征性的病變是在病變的肌肉與皮膚真皮中分布有大量境界清晰的大小不等、圓形或橢圓形的霉菌性肉芽腫，肉芽腫中心為菌絲體(圖2B、2C)，PASM染色呈黑色(圖2D)，其外由大量上皮樣細胞包繞，再外則是纖維細胞圍繞形成境界清晰的肉芽腫結節。除肝有一定程度的空泡變性外，鰓、脾、腎與心等內臟器官無明顯的病變，PASM染色也未見菌絲體。從兩地患病魚潰瘍組織中提取霉菌DNA，基于侵入絲囊霉菌ITS基因的特異性PCR檢測，結果呈陽性(圖3)。

2.3 侵入絲囊霉菌的分離與形態學觀察

從兩地患病魚潰瘍灶取的肌肉塊置于GP瓊脂，25 ℃條件下培養并每日觀察，至肉眼可見有纖細菌絲體在培養基上形成(分別命名為BW1和BW3)，將分離純化的菌絲體連帶瓊脂塊轉移至GP肉湯中。培養12h后在顯微鏡下觀察，可見形態單一、直徑10~30nm的纖細菌絲漂浮在GP肉湯中(圖4A)。將菌絲從瓊脂塊洗脫后置于無菌池塘水中，20 ℃培養12h后在倒置顯微鏡下觀察，可見原孢子囊在菌絲體體部形成(圖4B)。

2.4 分離絲囊霉菌ITS 基因序列分析

采用真菌DNA提取試劑盒提取分離霉菌BW1與BW3的全基因組DNA作為模板，使用侵入絲囊霉菌特異性引物PCR擴增ITS基因部分序列，結果擴增550bp的預期目的片段(圖3)，TA克隆測序后上傳GenBank獲得登錄號分別為ON175890與ON175891。在以ITS部分基因序列及其近緣種的ITS序列采用鄰接法構建系統發育樹(圖5)，BW1(ON175890)和BW3(ON175891)與侵入絲囊霉菌聚為一支，其ITS基因序列相似性分別為99.64%和99.46%。

3 討論與結論

大口黑鱸作為我國漁業重要主導養殖品種，時常發生以體表潰瘍為臨床病變特征的疾病給其健康養殖造成威脅，現已報道引發大口黑鱸出現體表潰瘍的病原有維氏氣單胞菌Aeromonas veronii、溫和氣單胞菌A. sobria、弗氏檸檬酸桿菌Citrobacterfreundii、鰤諾卡菌Nocardia seriolae和大口黑鱸虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus) 等。近年來養殖大口黑鱸在冬春兩季流行一種以潰瘍為臨床病變特征的疫病，其病因尚不清楚，我們前期進行了已報道相關病原的檢測，結果未檢出相關病毒，偶爾檢出運動性氣單胞菌，但并非所有的樣本都能檢出。本研究分別于2020年11月與2021年3月從四川兩養殖場采集自然發病病料，采用病原學、病理學和分子生物學相結合的方法對患病魚進行研究，所有的患病魚發現相同的病理損傷特征，也均檢出侵入絲囊霉菌，從而證實大口黑鱸冬春季流行的潰瘍癥是侵入絲囊霉菌感染所致。該結果不僅為大口黑鱸冬春季流行的潰瘍癥的防控提供了依據，同時也表明侵入絲囊霉菌可自然感染大口黑鱸，并造成較為嚴重的危害，因此，在大口黑鱸養殖中對侵入絲囊霉菌感染引起的流行性潰瘍綜合癥(EUS)應給予高度關注。

自1971年在日本報道侵入絲囊霉菌感染養殖香魚引發EUS以來，EUS已在非洲、澳洲、南亞和美洲等地多個國家流行，已知可感染160多種魚類，被認為是水生動物病原中感染宿主最廣的病原，對養殖與野生魚類都造成較大危害。在我國盡管不時有疑似EUS的報道，但都未確診，直到2019年常藕琴等發現在珠江三角洲養殖的雜交鱧潰瘍病是侵入絲囊霉菌感染所致，從而證實了侵入絲囊霉菌在我國的存在及其對養殖鱧的危害。本研究首次報道了侵入絲囊霉菌對我國養殖大口黑鱸的感染與致病，表明侵入絲囊霉菌不僅危害到我國養殖的雜交鱧，同時對養殖的大口黑鱸也造成危害。有報道表明，在印度1988年首次爆發EUS后，至2017年EUS已對30多種魚類造成危害，尤其是印度鯉等的危害較為嚴重。我國是世界水產養殖第一大國，水產養殖品種豐富，包括鲇形目、鯉形目與鱸形目的諸多品種，尤其是鯉形目的草魚、鯉、鯽、鰱鳙與鲇形目的黃顙魚等在我國水產養殖中具有重要的地位，因此，應開展侵入絲囊霉菌對我國上述重要水產養殖品種的易感性研究，同時開展EUS在我國的流行病學調查，以科學評估EUS對我國水產養殖的威脅，同時為科學防控EUS提供必要的參考。

本研究發現，侵入絲囊霉菌感染時，大口黑鱸肌肉中出現明顯的肉芽腫，與鰤諾卡菌感染大口黑鱸相似，但鰤諾卡菌感染不僅在肌肉中出現肉芽腫，同時在腎、脾與肝等內臟器官也很易發生，而前者僅見于肌肉中；另外，鰤諾卡菌感染形成的肉芽腫中心為干酪樣壞死，而侵入絲囊霉菌感染中心為菌絲體，形成典型的霉菌性肉芽腫。Lilley等提出多核巨細胞和霉菌性肉芽腫是EUS病理診斷的金標準，據報道在斑點胡子鲇、歐洲鲇、短棘鮰和斑點叉尾鮰等魚類與鱸形目的羅非魚發生EUS時確實出現明顯的上述病變，但在烏鱧、攀鱸和無鰾石首魚等鱸形目魚類則未見多核巨噬細胞，本研究中大口黑鱸感染侵入絲囊霉菌時形成的肉芽腫內也未見多核巨噬細胞，出現這種差異的原因可能與不同種屬魚類的先天免疫應答差異有關，因此，魚類EUS的診斷應在潰瘍、霉菌性肉芽腫的病理學特征的基礎上，結合病原學的檢測才更為準確。鑒于EUS的危害性，其已被我國列為動物二類疫病，一旦確診發生該病應根據《中華人民共和國動物防疫法》的相關要求采取嚴格控制、撲滅等措施，防止擴散，養殖水體應避免直接向天然水域排放，從而防止侵入性絲囊霉菌的子囊孢子更大范圍地傳播與擴散。盡管有研究表明，福爾馬林、H2O2、ZnO3 納米顆粒與ClO2在體外具有一定的殺滅侵入性絲囊霉菌的作用，但用于臨床病例的治療效果還有待評估，對于EUS目前鮮有有效的治療方法。另有報道，EUS暴發時水體pH多在4.5~6.0，同時飼料中添加決明子等中藥提取物與殼聚糖等能明顯增強魚類抗侵入絲囊霉菌的能力，因此，在大口黑鱸養殖過程中應注重水質的調控，同時在飼料中添加殼聚糖等免疫刺激劑以增強其免疫力，降低EUS的發生風險。

參考文獻：略

來源：華南農業大學學報 Journal of South China Agricultural University 2023, 44(4): 549-555

備注：西南漁業網對內容略有改動并配圖