2026年4月29日，美國(guó)埃默里大學(xué)梁波團(tuán)隊(duì)在Nature Communications發(fā)表題為“Orchestrated and dynamic nucleotide addition cycle during respiratory syncytial virus early-stage elongation”的研究論文。該研究利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)，捕捉了呼吸道合胞病毒聚合酶在早期RNA延伸過程中的多個(gè)關(guān)鍵構(gòu)象狀態(tài)，系統(tǒng)揭示了RSV聚合酶在核苷酸添加循環(huán)中的動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化與催化機(jī)制。研究還首次在NTP結(jié)合狀態(tài)和轉(zhuǎn)位后狀態(tài)中觀察到RSV聚合酶L蛋白全部五個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，為理解單負(fù)鏈RNA病毒RNA合成機(jī)制，以及開發(fā)靶向病毒聚合酶的抗病毒藥物提供了重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是一種高度傳染性的人類病原體。嬰幼兒、老年人、免疫功能受損人群以及心肺疾病患者均是RSV感染的高危人群。RSV屬于肺病毒科（Pneumoviridae）單負(fù)鏈RNA病毒，其基因組為單鏈負(fù)義RNA。RSV的RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制由RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）催化完成。該聚合酶復(fù)合物由多功能聚合酶蛋白L（Large protein）和輔助因子磷蛋白P（Phosphoprotein）組成。其中，L蛋白包括五個(gè)結(jié)構(gòu)域：RNA依賴性RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域（RdRp）、加帽結(jié)構(gòu)域（Cap）、連接結(jié)構(gòu)域（CD）、甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（MT）和C末端結(jié)構(gòu)域（CTD）。P蛋白則主要包括N端結(jié)構(gòu)域（PNTD）、寡聚化結(jié)構(gòu)域（POD）和C端結(jié)構(gòu)域（PCTD）（圖1a）。

RSV的RNA合成過程包括起始、延伸和終止三個(gè)階段。在RNA延伸過程中，聚合酶通過不斷重復(fù)核苷酸添加循環(huán)，逐步延長(zhǎng)新生RNA產(chǎn)物鏈。一個(gè)典型的核苷酸添加循環(huán)通常包括四個(gè)主要步驟：首先，新的核苷三磷酸進(jìn)入聚合酶活性中心，并與模板RNA的+1位點(diǎn)堿基配對(duì)；隨后，活性位點(diǎn)閉合，使RNA模板、RNA產(chǎn)物、核苷酸、催化金屬離子和聚合酶處于適合催化的位置；接著，新的磷酸二酯鍵形成，并伴隨焦磷酸釋放；最后，RNA模板-產(chǎn)物雙鏈向前轉(zhuǎn)位一個(gè)堿基對(duì)，使+1位點(diǎn)重新空出，為下一輪核苷酸添加做好準(zhǔn)備。

此前，梁波團(tuán)隊(duì)已經(jīng)解析了啟動(dòng)子RNA結(jié)合狀態(tài)下的RSV聚合酶結(jié)構(gòu)，揭示了RSV RNA合成起始階段的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。然而，在RNA延伸過程中，聚合酶如何招募新的核苷三磷酸、如何完成磷酸二酯鍵形成，以及如何推動(dòng)RNA模板-產(chǎn)物雙鏈向前轉(zhuǎn)位，仍缺乏直接的結(jié)構(gòu)證據(jù)。尤其是，RSV聚合酶L蛋白中的CD、MT和CTD結(jié)構(gòu)域在以往解析的apo狀態(tài)和啟動(dòng)子結(jié)合狀態(tài)中高度柔性，未能被解析，其在RNA合成過程中的結(jié)構(gòu)狀態(tài)和功能作用仍不明確。

在本研究中，為捕捉RSV聚合酶在延伸過程中的不同構(gòu)象狀態(tài)，作者設(shè)計(jì)了一種發(fā)夾狀RNA模擬物Tr3-mimic，以提高RNA模板與引物之間的配對(duì)效率（圖1b）。隨后，作者將RSV聚合酶分別與不同RNA底物、核苷酸或核苷酸類似物組裝，并通過冷凍電鏡解析了早期RNA延伸過程中的四種核苷酸添加循環(huán)關(guān)鍵狀態(tài)：NTP結(jié)合狀態(tài)、反應(yīng)前狀態(tài)、轉(zhuǎn)位前狀態(tài)和轉(zhuǎn)位后狀態(tài)（圖1c）。其中，NTP結(jié)合狀態(tài)和轉(zhuǎn)位后狀態(tài)的結(jié)構(gòu)顯示出L蛋白全部五個(gè)結(jié)構(gòu)域；而反應(yīng)前狀態(tài)和轉(zhuǎn)位前狀態(tài)與apo狀態(tài)及啟動(dòng)子結(jié)合狀態(tài)相似，僅能解析L蛋白中的RdRp和Cap兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。

圖1：RSV聚合酶結(jié)構(gòu)組成、Tr3-mimic RNA設(shè)計(jì)及早期RNA延伸過程中四種核苷酸添加循環(huán)關(guān)鍵狀態(tài)的轉(zhuǎn)換示意圖

將RSV聚合酶與TrC3-mimic和ApNpp在室溫下孵育后，作者獲得了分辨率為3.08 ?的NTP結(jié)合狀態(tài)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)包括L蛋白的五個(gè)結(jié)構(gòu)域，以及P蛋白的POD和PCTD結(jié)構(gòu)域（圖2a-b）。高分辨率冷凍電鏡密度圖顯示出清晰的RNA雙鏈、核苷酸類似物ApNpp，以及一個(gè)位于催化殘基D700、D811和ApNpp之間的鎂離子（圖2c）。結(jié)構(gòu)分析顯示，RdRp和Cap結(jié)構(gòu)域共同形成類似“碗狀”的催化核心，而在apo狀態(tài)和啟動(dòng)子結(jié)合狀態(tài)下高度柔性的CD、MT和CTD結(jié)構(gòu)域則位于該“碗狀”結(jié)構(gòu)上方（圖2d）。CD-MT-CTD模塊與RdRp-Cap模塊之間的相互作用整體較弱，主要由supporting helix和supporting loops等局部結(jié)構(gòu)元件介導(dǎo)（圖2e-h）。

圖2：RSV聚合酶NTP結(jié)合狀態(tài)結(jié)構(gòu)，以及五結(jié)構(gòu)域L蛋白中RdRp-Cap模塊與CD-MT-CTD模塊之間的相互作用

進(jìn)一步比較apo狀態(tài)、啟動(dòng)子結(jié)合狀態(tài)以及四種RNA延伸狀態(tài)后，作者發(fā)現(xiàn)RSV聚合酶在RNA合成過程中的構(gòu)象變化可分為兩個(gè)層面。第一個(gè)層面是宏觀結(jié)構(gòu)域重排，主要表現(xiàn)為與supporting helix和supporting loops相關(guān)的CD、MT和CTD結(jié)構(gòu)域在不同狀態(tài)中的有序化和無序化。第二個(gè)層面是活性中心附近保守微觀motif的精細(xì)構(gòu)象調(diào)整，包括motif A、motif C、motif D和motif F在不同催化狀態(tài)中的動(dòng)態(tài)變化。

其中，supporting helix和supporting loops在不同狀態(tài)中呈現(xiàn)“開放”和“閉合”兩種構(gòu)象，與CD-MT-CTD模塊的穩(wěn)定性及構(gòu)象變化密切相關(guān)。啟動(dòng)子RNA結(jié)合可誘導(dǎo)motif F發(fā)生構(gòu)象變化，其保守氨基酸殘基K619參與穩(wěn)定+1位點(diǎn)的模板核苷酸。在apo狀態(tài)和啟動(dòng)子結(jié)合狀態(tài)中，含有催化位點(diǎn)GDN的motif C呈伸展?fàn)顟B(tài)，motif A也靠近催化位點(diǎn)；而在RNA延伸狀態(tài)中，motif C發(fā)生彎曲，motif A向外移動(dòng)，從而為RNA產(chǎn)物鏈和新進(jìn)入的核苷酸提供空間。同時(shí)，motif D中的K856在NTP結(jié)合狀態(tài)和反應(yīng)前狀態(tài)中靠近核苷酸的三磷酸基團(tuán)，而在催化完成后遠(yuǎn)離活性中心。

這些結(jié)果表明，RSV聚合酶在RNA延伸過程中并不是簡(jiǎn)單重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，而是通過多結(jié)構(gòu)域、多保守motif、RNA底物、核苷酸和金屬離子之間的動(dòng)態(tài)協(xié)同調(diào)控，連續(xù)完成RNA模板識(shí)別、核苷酸選擇、磷酸二酯鍵形成和RNA轉(zhuǎn)位等關(guān)鍵步驟。

綜上所述，該研究首次系統(tǒng)捕捉了RSV聚合酶在早期RNA延伸過程中的四個(gè)關(guān)鍵核苷酸添加循環(huán)狀態(tài)，揭示了RNA模板、RNA產(chǎn)物、核苷酸、鎂離子以及聚合酶保守motif之間的動(dòng)態(tài)協(xié)同關(guān)系。該研究不僅補(bǔ)全了RSV聚合酶從RNA合成起始到早期延伸階段的重要結(jié)構(gòu)圖景，也為理解單負(fù)鏈RNA病毒聚合酶的共性機(jī)制和病毒特異性調(diào)控提供了重要依據(jù)。由于RSV聚合酶是抗病毒藥物開發(fā)的重要靶點(diǎn)，這些結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)也為開發(fā)靶向RSV及相關(guān)病毒聚合酶的廣譜抗病毒策略提供了新的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，相關(guān)病毒包括狂犬病毒、尼帕病毒和埃博拉病毒等。

文章通訊作者為梁波博士。梁波博士本科畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，博士畢業(yè)于佛羅里達(dá)州立大學(xué)，隨后在哈佛醫(yī)學(xué)院開展博士后研究，現(xiàn)為美國(guó)埃默里大學(xué)副教授。梁波實(shí)驗(yàn)室主要結(jié)合冷凍電鏡、晶體學(xué)和生物化學(xué)方法，研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能機(jī)制，研究方向包括單負(fù)鏈RNA病毒RNA合成機(jī)制以及神經(jīng)生物學(xué)疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的折疊機(jī)制。團(tuán)隊(duì)目前正在招聘博士后，歡迎感興趣的學(xué)生聯(lián)系梁波實(shí)驗(yàn)室(https://med.emory.edu/departments/biochemistry/research-labs/liang/index.html)；

文章第一作者為曹冬冬博士，現(xiàn)為美國(guó)埃默里大學(xué)梁波團(tuán)隊(duì)副研究員。曹冬冬博士本科畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，并于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)獲得博士學(xué)位。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-72519-0