近日，天津醫科大學腫瘤醫院楊吉龍教授、天津醫科大學黃丹丹教授、天津醫科大學/廣州市婦女兒童醫療中心李俊教授及溫州醫科大學甌江實驗室王朝研究員鼎立合作，在國際期刊Advanced Science上在線發表題為Genome-Wide CRISPR Screen Identifies a microRNA OrchestratingPleiotropic Resistance to Targeted Therapy and T Cell Immunity in Melanoma的研究論文。該研究從全基因組水平系統性揭示了微小RNA（miRNA）在黑色素瘤“靶向-免疫”交叉耐藥中的關鍵調控作用，為克服復雜耐藥機制提供了全新視角和潛在治療策略。

黑色素瘤治療中的“交叉耐藥”困境

黑色素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤之一，全球每年新發病例超過30萬，死亡病例約6萬。BRAF/MEK靶向治療和PD-1/CTLA-4免疫檢查點治療雖顯著改善了晚期患者的預后，但大量患者在治療過程中先后或同時對靶向藥物和免疫治療產生耐藥，形成所謂“交叉耐藥”。一線治療失敗的患者往往對后續方案的應答率大幅下降，導致不可逆的疾病進展。然而，驅動這一多重耐藥的上游分子機制，尤其是非編碼RNA在其中的角色，長期以來懸而未決。

全基因組篩選鎖定關鍵分子miR-18a

為系統解析miRNA在交叉耐藥中的作用，研究團隊自主構建了一款新型全基因組miRNA CRISPR敲除文庫。該文庫整合miRBase v21與FANTOM5數據庫中的2,185條miRNA，共設計8,598條sgRNA，在覆蓋廣度和靶向精度上均顯著優于已有文庫。以BRAF V600E突變型黑色素瘤A375細胞為模型，團隊開展了兩套平行篩選：分別評估miRNA缺失對BRAF抑制劑維莫非尼（VEM）的耐藥效應和對CD8? T細胞殺傷的耐受效應。兩套篩選的生物學重復性均較高（Spearman相關系數≥0.9）。正向選擇分析發現，miR-18a在兩套篩選中均顯著富集，是同時關聯靶向治療耐藥與免疫逃逸的關鍵候選分子。

后續驗證表明，在A375、SK-MEL-28以及鼠源YUMM1.7細胞系中，miR-18a敲除均賦予細胞對VEM、MEK抑制劑及ERK抑制劑的顯著耐藥性，同時削弱CD8? T細胞的殺傷效力；而重新引入miR-18a-5p或miR-18a-3p可大幅恢復藥物敏感性和免疫易感性，證實了miR-18a的核心調控地位。

臨床隊列證實miR-18a下調與治療耐藥及不良預后密切相關

為深入探究miR-18a下調與黑色素瘤靶向和免疫治療耐藥的關系，研究團隊首先構建了A375 VEM耐藥株（A375-VR）和耐CD8? T細胞殺傷株（A375-TR）。與親本株相比，兩種耐藥細胞中miR-18a的表達均顯著下調；而過表達miR-18a-mimic可顯著逆轉耐藥表型。

進一步，團隊整合了來自七個治療隊列的120對（61對靶向治療，59對免疫治療）黑色素瘤患者縱向RNA-seq和臨床數據。系統性分析表明，在BRAFi/MEKi靶向治療或抗PD-1/CTLA-4免疫治療期間，miR-18a活性降幅越大，治療應答越差、生存預后越不理想；miR-18a活性變化還與腫瘤浸潤CD8? T細胞比例呈顯著正相關。

揭示“一箭雙雕”的平行調控機制

轉錄組和單細胞測序分析提示，miR-18a缺失可能通過兩條平行信號通路分別介導兩種耐藥表型：一方面通過Hippo信號通路影響靶向藥物敏感性；另一方面通過TGF-β信號通路影響CD8? T細胞殺傷效應。

機制研究表明，miR-18a通過兩條平行的信號通路分別調控兩種耐藥表型：

1. 靶向治療耐藥——AJUBA/Hippo/YAP軸。 miR-18a-5p直接靶向Hippo通路負調控因子AJUBA。miR-18a缺失解除對AJUBA的抑制，導致LATS1/2激酶活性降低、YAP去磷酸化并核轉位，激活促存活基因CTGF和CYR61的轉錄，驅動BRAF抑制劑耐藥。裸鼠移植瘤模型中，miR-18a-5p mimics或YAP抑制劑（verteporfin、VT3989）聯合VEM可顯著抑制耐藥腫瘤生長。

2. 免疫耐受——THBS1/CD47軸。miR-18a-5p同時直接靶向THBS1。miR-18a缺失使腫瘤細胞高表達THBS1，后者與CD8? T細胞表面CD47結合，損害免疫突觸形成，削弱T細胞殺傷活性。在C57BL/6小鼠同基因移植瘤模型中，瘤內注射miR-18a-5p mimics顯著抑制腫瘤生長；單細胞測序證實TGF-β信號減弱、Thbs1–Cd47通訊降低、CD8? T細胞浸潤增加。CD47阻斷抗體magrolimab同樣可逆轉miR-18a缺失引起的免疫逃逸。

綜上，miR-18a作為上游樞紐，將腫瘤內在耐藥信號與免疫微環境重塑統一于同一調控框架之下，實現了“一箭雙雕”的平行調控。

上游調控因子的發現與臨床驗證

研究進一步發現，RNA結合蛋白 hnRNP A1 是miR-18a的關鍵上游調控因子，通過促進pre-miR-18a的加工成熟維持miR-18a水平。靶向藥物或T細胞殺傷的治療壓力下，hnRNP A1表達下調，導致miR-18a降低，從而啟動雙重耐藥通路。RIP實驗與正反向救援實驗一致支持“hnRNP A1→ miR-18a → AJUBA/THBS1”的單向調控級聯。

在臨床層面，在天津醫科大學腫瘤醫院 53例獨立驗證隊列中，組織芯片免疫組化與原位雜交證實hnRNP A1高表達與miR-18a高表達顯著相關（P = 6.1 × 10?13），為調控機制提供了臨床佐證。

新的聯合治療策略與展望

基于上述發現，團隊提出了針對多重耐藥的潛在干預策略：恢復腫瘤內miR-18a表達，或聯合使用YAP–TEAD抑制劑（verteporfin、VT3989）和CD47阻斷抗體（magrolimab），有望同步逆轉靶向藥物耐藥與免疫逃逸。該研究首次在全基因組水平系統描繪了miRNA介導黑色素瘤交叉耐藥的分子框架，為開發新型聯合治療方案和預測性生物標志物奠定了基礎。

圖 miR-18a與黑色素瘤耐藥機制模擬圖

王朝研究員、劉昊天博士、王雪琪博士生、滕建謹碩士為文章的共同第一作者。李俊教授、黃丹丹教授和楊吉龍教授為文章的共同通訊作者。

原文鏈接：http://doi.org/10.1002/advs.202515158

制版人：十一

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