抗體偶聯藥物（ADC）憑借其單克隆抗體的特異性，旨在將細胞毒性藥物精準遞送至癌細胞，同時最大限度地降低對健康組織的毒性，是當前腫瘤治療領域備受矚目的創新力量。然而，ADC復雜的分子結構也使其在開發過程中面臨聚集、錯誤折疊等挑戰，可能嚴重影響其藥代動力學、藥效乃至引發免疫原性。

2026年3月，一篇發表于Cancers雜志的綜述文章[1]，對ADC的生物物理和結構表征技術展開深入探討，并強調在早期研發階段運用這些技術的重要性。通過精確測量熔解溫度（Tm）、藥物抗體比（DAR）、靶標親和力、自締合與聚集、共價修飾及構象變化等關鍵參數，可有效識別并規避潛在問題，顯著降低后期昂貴的體內實驗和臨床試驗風險。文章還前瞻性地展望了外源基質研究和人工智能/機器學習（AI/ML）在加速ADC開發中的應用潛力，為構建更高效、更安全的ADC研發流程指明了方向。本文特將相關內容整理如下，以饗讀者。

ADC的研發挑戰

癌癥是全球主要死因之一，2022年新增病例達2000萬，死亡人數占全球死亡人數的六分之一。傳統化療存在脫靶毒性與嚴重副作用，ADC藥物憑借單抗靶向性精準遞送細胞毒性藥物，減少正常組織損傷。自2000年首個 ADC藥物（吉妥珠單抗奧佐米星）獲美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市以來，截至2025年3月，FDA已批準16款，全球超400款在研，200余款進入臨床試驗。

ADC由單抗、連接體和毒性載荷組成，因結構復雜，易出現各類缺陷：如單克隆抗體可能因分子間相互作用而發生聚集，若涉及免疫系統，可能誘發患者產生抗藥物抗體（ADA），進而導致療效降低、清除率增加及其他不良反應。此外，連接體在循環過程中過早裂解會導致藥物載荷的丟失，并在健康細胞中產生潛在的脫靶效應。藥物載荷和單克隆抗體本身也可能發生甲硫氨酸氧化、天冬酰胺和谷氨酰胺脫酰胺等化學修飾。

抗體錯誤折疊是影響其體內藥代與藥效的關鍵因素。易錯誤折疊的藥物易出現藥代異常、藥效下降、免疫原性升高及毒性風險。目前已有大量研究致力于確定使單克隆抗體和ADC候選藥物傾向于此類不良行為的生物物理特征，也有多種體外技術可檢測其結構與穩定性，但對于體內復雜微環境對藥物結構特性的影響，仍知之甚少。理解這些藥物的體內處理機制十分重要。

生物物理和結構表征是深入理解哪些ADC候選藥物能夠安全、有效且表現良好的關鍵環節。在開發早期階段，戰略性地利用生物物理表征技術，有助于在耗資巨大的體內實驗和臨床試驗之前，及時發現并規避潛在的“問題分子”，從而實現更高效的研發流程，最終為廣大癌癥患者提供更安全、更有效的ADC療法。

ADC的關鍵參數與表征技術

Tm

Tm代表蛋白質或其結構域50%折疊時的溫度，而聚集溫度（Tagg）則指蛋白質開始聚集的溫度。以上兩個參數都可以用來衡量蛋白質的熱穩定性，因此在開發過程中，它們有助于選擇出穩定性較好的蛋白質或配方。差示掃描量熱法（DSC）是一種廣泛使用的蛋白質熱穩定性檢測工具，通過測量蛋白質熱變性引起的熱焓變化（?H），揭示影響分子折疊和穩定性的因素，Tm越高表明熱穩定性越強。既往一項研究通過將工程化肽段偶聯至Fc區，制備了Fc區Tm更高的ADC，作者將其歸因于偶聯肽段對Fc區分子動力學或熵的限制。另有研究觀察到，與單克隆抗體相比，特定位點偶聯載荷的ADC熱穩定性有所降低——DSC檢測到ADC的CH2結構域Tm降低，而差示掃描熒光法（DSF）則進一步發現CH2和Fab結構域的Tm均有所降低，提示偶聯載荷可能導致ADC結構穩定性下降。此外，圓二色譜（CD）亦可用于報告蛋白質的二級結構含量，并通過監測CD信號隨溫度變化來確定Tm。

DAR

DAR是ADC設計和療效的關鍵參數，表示每個單克隆抗體偶聯的細胞毒性載荷分子數量，其典型值可從2到8不等。雖然體外研究中較高的DAR可能看似更有效，但研究發現，DAR較高的ADC血漿清除率往往高于DAR較低的ADC，這可能與DAR和ADC疏水性之間的正相關關系有關。測定ADC DAR的常用技術包括通過紫外或可見光吸收測量單克隆抗體和載荷各自最大吸收波長（最大吸收波長）處的吸光度來計算平均DAR。色譜法，如疏水相互作用液相色譜（HIC）和反相高效液相色譜（RP-HPLC），能進一步量化平均DAR并表征藥物偶聯分子的分布，既往研究即利用HIC研究了DAR對ADC穩定性和療效的影響。完整質譜（MS）則能提供總抗體、游離載荷和偶聯ADC的定量信息，以及共價修飾和翻譯后修飾（PTM）的分布，有研究曾通過天然質譜監測體內DAR和游離藥物濃度的變化。

靶標親和力

ADC的抗體組分須具備高靶點特異性和高抗原結合親和力，以確保載荷的精準遞送。解離常數（Kd）常用于量化抗體與抗原間的親和力，Kd值越低，結合親和力越高。表面等離子共振（SPR）、生物層干涉（BLI）和酶聯免疫吸附測定（ELISA）是常用的配體結合技術，用于測量結合強度和速率。有研究將SPR應用于卵巢癌ADC開發，成功篩選出具有理想親和力和增強內化能力的抗體－靶點對。另一研究則利用BLI識別了用于治療實體瘤的抗GD2 ADC。

自締合與聚集

蛋白質的自締合與聚集是ADC開發中的重大挑戰，尤其在高濃度制劑中。自締合指溶液中分子間弱的、非共價引力導致的聚集，可引發高粘度、相分離及不可逆聚集。蛋白質聚集可能導致不良免疫原性，從而降低治療效果，因此預測自締合風險至關重要。第二維里系數（B?）可衡量稀溶液中分子間的非特異性相互作用，正值表示排斥，負值表示吸引。動態光散射（DLS）和靜態光散射（SLS）是測量B?的常用方法。有研究利用DLS揭示ADC中結構修飾可增加蛋白質-蛋白質相互作用，而另一研究比較兩種ADC后發現，帶負電荷末端基團的ADC吸引相互作用顯著增加，即便其載荷疏水性較低。分析超速離心（AUC）和尺寸排阻色譜（SEC），尤其是SEC-MALS（SEC聯用SLS技術）也被廣泛用于檢測和量化蛋白質聚集體。

共價修飾

ADC在生產、儲存和給藥過程中易發生共價修飾，包括N－連接糖基化、糖化、氧化、脫酰胺和異構化。這些修飾會改變單克隆抗體的熱力學穩定性、疏水性、結構和電荷，增加聚集風險，并可能導致免疫原性和影響血漿半衰期。MS技術常與色譜聯用，為糖基化狀態和聚糖組成提供見解。去糖基化可升高IgG1聚集率，而Fc N-聚糖對Fc受體（FcR）相互作用及抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）等效應功能至關重要。糖化作為非酶促修飾，影響電荷異質性和聚集。有研究利用質譜成功識別并量化了德曲妥珠單抗的糖化及其他PTM。氧化和脫酰胺是最常見的化學降解方式，甲硫氨酸和色氨酸易被氧化，天冬酰胺易脫酰胺。此外有研究發現，ADC的互補決定區（CDR）中天冬酰胺脫酰胺可能影響抗原結合和細胞毒性。琥珀酰亞胺中間體形成不僅限于脫酰胺，天冬氨酸和谷氨酸也易受影響。另有研究發現琥珀酰亞胺在CDR中積累會降低其效力。也有研究利用液相色譜-質譜（LC-MS）表征了吡咯并苯二氮卓（PBD）ADC中天冬氨酸的異構化，觀察到結合力變化，提示可能導致三級結構改變。

硫醇-馬來酰亞胺連接體是已批準ADC的常見連接體，但其可能與人血清白蛋白（HSA）中的游離半胱氨酸殘基反應，形成白蛋白連接體－載荷加合物，導致脫靶毒性。其他連接體降解機制包括酸性降解及血漿和溶酶體蛋白酶裂解。有研究曾利用血漿孵育結合質譜方法評估ADC的生物轉化，并通過酶解和肽圖分析定位修飾。ELISA也可用于測量血漿孵育后載荷的丟失。連接體裂解測定對于理解載荷釋放機制及控制其釋放以防脫靶毒性至關重要，可根據觸發因素分組：酶促裂解、酸不穩定裂解和氧化還原不穩定裂解。

構象變化

單克隆抗體作為動態分子，在共價修飾、配體結合或環境變化后可能展現出構象變化。氫氘交換質譜（HDX-MS）是一種高分辨率溶液基技術，可探測蛋白質構象和動力學變化。有研究利用HDX-MS研究位點特異性ADC的結構完整性，發現藥物偶聯僅輕微擾動了CH2結構域的骨架酰胺氫鍵網絡，并未影響單克隆抗體的整體結構完整性。此外有研究則通過固態HDX-MS研究了賦形劑對ADC儲存穩定性的影響。

小結

為顯著提升ADC的治療效果，在藥物的開發、儲存及患者體內循環的各個階段，深入理解其生物物理行為至關重要。這一綜述全面總結了當前用于表征ADC各項關鍵生物物理和結構參數的現有技術，為構建更高效、更安全的ADC研發流程指明了方向。同時，綜述中提及AI/ML方法在加速治療性蛋白質開發方面展現出廣闊前景。AI/ML已在抗體設計和從頭設計治療性蛋白質方面取得顯著進展。盡管治療方案可開發性的計算優化仍是一個未解決的問題，但AI/ML對單克隆抗體及其他蛋白質生物物理和藥代動力學特性的預測能力，有望為更詳細的實驗研究揭示意想不到的方向。通過將這些復雜的推斷方法與ADC及其他治療性蛋白質體內行為的新見解相結合，有望使這些候選藥物的開發過程更快捷、更高效。

參考文獻

[1] Mariano IP, Nath A. Biophysical and Structural Characterization of Antibody–Drug Conjugates. Cancers. 2026; 18(6):917.

審批編號：CN-183868

有效期至：2027-05-11

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撰寫：Andy

審校：River

排版：Atai

執行：Zelda

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