2026年4月10日，中國藥科大學天然藥物國家重點實驗室李萍、李飛團隊聯(lián)合新疆第二醫(yī)學院藥學院李建光團隊、江蘇省中醫(yī)院/南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨科王磊團隊，在Phytomedicine（中科院1區(qū)TOP期刊，IF=8.3）在線發(fā)表題為 “Echinacoside targets HSC70 to inhibit osteoclastogenesis and ameliorate ovariectomy-induced osteoporosis” 的研究論文。該研究聚焦天然產(chǎn)物松果菊苷（Echinacoside, ECH）抗骨質疏松的關鍵靶點與分子機制，首次系統(tǒng)揭示HSC70是ECH調控骨重塑、抑制破骨細胞生成的重要直接靶點。

骨質疏松癥是最常見的代謝性骨病之一，其核心病理在于骨形成與骨吸收失衡，尤其是破骨細胞過度活化導致骨量快速丟失。現(xiàn)有治療策略多集中于促進成骨或抑制骨吸收的單一環(huán)節(jié)，而能夠兼具“促成骨—抗破骨”雙重調控潛力的藥物仍相對有限。因此，尋找新的骨重塑調控靶點，并開發(fā)精準干預策略，是骨質疏松防治領域的重要方向。

松果菊苷是來源于肉蓯蓉的天然苯乙醇苷類化合物，既往研究提示其具有改善骨丟失的潛力，但其是否能夠直接調控破骨細胞生成，以及背后的精確靶點仍不清楚。本研究通過小分子親和層析、LC-MS/MS蛋白篩選、分子動力學模擬、RANKL誘導破骨細胞生成模型、OVX誘導骨質疏松大鼠模型以及臨床樣本驗證，構建了從“靶點發(fā)現(xiàn)—機制解析—動物驗證—臨床相關性觀察”的完整證據(jù)鏈。

研究發(fā)現(xiàn)，HSC70是松果菊苷發(fā)揮抗破骨細胞生成作用的關鍵細胞靶點。分子動力學模擬進一步確認，HSC70的ARG36和ARG272是ECH結合的主要氨基酸位點，二者共同支撐了ECH-HSC70復合物的穩(wěn)定形成。更重要的是，HSC70在骨質疏松細胞模型、OVX大鼠模型以及臨床骨質疏松患者樣本中均呈現(xiàn)明顯上調，提示HSC70不僅是一個藥物結合靶點，更可能是參與骨質疏松發(fā)生發(fā)展的關鍵調控因子。

機制上，ECH通過靶向HSC70促進IKKβ發(fā)生泛素化介導的降解，從而抑制IKKβ-NF-κB信號軸活化，最終阻斷破骨細胞分化及骨吸收功能。與ECH處理結果一致，敲低Hsc70同樣能夠抑制TRAP陽性破骨細胞形成、F-actin環(huán)形成及骨吸收活性，進一步證明HSC70在破骨細胞生成中的關鍵作用。

在體內實驗中，ECH顯著改善OVX誘導的大鼠骨丟失和骨代謝紊亂，提高骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度，并降低骨吸收相關指標。進一步的功能驗證顯示，Hsc70過表達可在正常大鼠中誘導骨丟失，而Hsc70敲低則可緩解OVX大鼠骨丟失；同時，無論過表達還是敲低Hsc70，均會削弱甚至消除ECH的治療作用，說明ECH的抗骨質疏松效應高度依賴其對HSC70的靶向調控。

該研究的亮點在于：一方面，從天然產(chǎn)物松果菊苷出發(fā)，明確了其抗骨質疏松作用的直接靶點HSC70；另一方面，揭示了“HSC70—IKKβ泛素化降解—NF-κB信號抑制—破骨細胞生成受阻”這一新的骨重塑調控軸。研究不僅拓展了HSC70在代謝性骨病中的功能認識，也為松果菊苷作為新型HSC70抑制劑的進一步開發(fā)提供了重要實驗依據(jù)。

總體來看，該研究將天然藥物活性成分、靶點發(fā)現(xiàn)技術和骨代謝疾病機制研究緊密結合，提出了以HSC70為核心的骨質疏松精準干預新思路。松果菊苷有望作為兼具天然產(chǎn)物優(yōu)勢和明確分子靶點的新型候選藥物，為代謝性骨病治療提供新的轉化方向。

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【摘要】

背景：松果菊苷（ECH）是一種從肉蓯蓉中分離獲得的天然苯乙醇苷類化合物，在抗骨質疏松癥（OP）方面顯示出良好的治療潛力。然而，其具體分子靶點及相關作用機制尚未完全闡明。

目的：本研究結合小分子親和層析、RANKL誘導的破骨細胞生成模型以及卵巢切除（OVX）誘導的大鼠骨質疏松模型，系統(tǒng)探討ECH發(fā)揮抗骨質疏松作用的分子靶點及機制。

方法：采用小分子親和層析和分子動力學模擬鑒定ECH的直接分子靶點及其潛在結合位點。隨后，結合分子生物學技術，利用RANKL誘導的破骨細胞生成模型進一步闡明ECH調控骨穩(wěn)態(tài)的分子機制。最后，在OVX誘導的大鼠骨質疏松模型中驗證ECH的體內抗骨質疏松作用。

結果：本研究發(fā)現(xiàn)，熱休克同源71 kDa蛋白（HSC70）是ECH調控破骨細胞生成的關鍵細胞靶點。HSC70的ARG36和ARG272氨基酸被證實為ECH的主要結合位點。值得注意的是，HSC70在骨質疏松模型和臨床患者樣本中均顯著上調。從機制上看，ECH通過促進IKKβ的泛素化介導降解來抑制破骨細胞生成。此外，敲低Hsc70表現(xiàn)出與ECH處理相似的生物學效應。體內研究證實，ECH通過靶向HSC70，顯著改善OVX誘導的大鼠骨質疏松模型中的骨丟失和代謝紊亂。具體而言，Hsc70過表達可在正常大鼠中誘導骨丟失；相反，Hsc70敲低可緩解OVX大鼠的骨丟失。此外，Hsc70過表達和敲低均會消除ECH在OVX大鼠中的治療作用。

結論：本研究揭示HSC70是骨重塑的新型調控因子，并提出ECH作為一種新的HSC70抑制劑，具有成為潛在治療藥物的前景。本研究為骨質疏松的發(fā)病機制提供了重要認識，并為代謝性骨病提出了一種創(chuàng)新的靶向治療策略。

01

研究背景及科學問題

骨質疏松癥（OP）是最常見的代謝性骨病，主要發(fā)生于絕經(jīng)后女性。其特征是骨密度（BMD）降低和骨微結構破壞，從而導致骨折風險升高。骨骼健康依賴于破骨細胞介導的骨吸收與成骨細胞介導的骨形成之間的動態(tài)平衡。OP表現(xiàn)為骨形成減少和破骨性骨吸收增強。針對骨重塑、同時調節(jié)合成代謝和分解代謝通路，是OP再生治療的一項基礎策略。目前OP治療主要通過促進成骨或抑制骨吸收來降低骨折風險。多數(shù)藥物治療通過靶向成骨細胞或破骨細胞來控制癥狀。然而，臨床上仍缺乏能夠同時促進骨形成并抑制骨吸收的有效藥物。

熱休克同源71 kDa蛋白（HSC70/HSPA8）是一種關鍵分子伴侶，具有組成型表達特點，對維持細胞穩(wěn)態(tài)至關重要，并參與蛋白折疊、轉運和降解等過程。HSC70與疾病病理生理過程關系密切，因此被認為是一個具有潛力的治療靶點。近期研究提示，HSC70與骨代謝異常之間存在緊密聯(lián)系。HSC70介導的PRL2自噬性降解對于破骨細胞形成和炎癥性骨破壞具有重要作用。此外，同時敲低HSC70和MNSFβ可抑制RANKL刺激下的破骨細胞形成。因此，利用天然來源小分子靶向HSC70并調節(jié)其活性，是一種有前景的OP治療方式。然而，利用天然化合物靶向HSC70以調控骨重塑，目前仍研究不足。

小分子親和層析是藥物靶點鑒定的有效方法。天然產(chǎn)物是藥物發(fā)現(xiàn)中生物活性化合物的重要來源。因此，探索具有骨重塑調控作用的天然化合物，有助于揭示其靶點及骨代謝中的新調控機制。松果菊苷（ECH）是來源于肉蓯蓉的一種活性苯乙醇苷類化合物，已顯示出神經(jīng)保護和抗癌作用。我們此前的研究表明，ECH可促進成骨細胞分化，并減輕卵巢切除（OVX）大鼠的骨丟失，提示其可能具有治療OP的潛力。然而，ECH對破骨細胞生成的調控作用及其抗骨質疏松的精確機制仍很大程度上未知。本研究旨在通過結合小分子親和層析以及一系列體內外實驗，探討ECH對破骨細胞生成的影響，并進一步闡明其潛在分子機制。

本研究利用ECH偶聯(lián)微珠進行小分子親和層析，并結合后續(xù)蛋白質譜篩選，鑒定HSC70為ECH的直接結合靶點。重要的是，HSC70在OP模型和臨床患者樣本中高表達。從機制上看，HSC70通過調控IKKβ泛素化來調節(jié)破骨細胞生成。ECH在體內通過直接靶向HSC70改善OVX誘導的骨丟失。綜上，本研究揭示了HSC70中可用于藥物干預的骨重塑熱點，并提出ECH可能作為治療代謝性骨病的潛在HSC70抑制劑。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

HSC70是ECH的細胞靶點

抑制破骨細胞生成是改善OP的有效策略。因此，我們首先在RANKL誘導的RAW 264.7細胞中評估ECH抑制破骨細胞生成的潛力。結果顯示，在最高50 μM濃度范圍內，ECH處理未產(chǎn)生明顯細胞毒性。隨后，我們考察了ECH的抗破骨細胞生成作用。ECH處理顯著阻斷了RANKL刺激下的破骨細胞生成。此外，ECH有效抑制了RANKL誘導的破骨細胞生成相關基因Nfatc1、Ctsk、c-Fos和Acp5的轉錄上調。ECH還顯著抑制了RANKL刺激的RAW 264.7細胞中F-actin環(huán)形成和骨吸收活性。總體而言，這些結果表明ECH可在體外有效抑制破骨細胞生成。

細胞靶點是ECH介導骨穩(wěn)態(tài)調節(jié)作用的分子基礎。為鑒定這些靶點，我們構建了ECH偶聯(lián)的環(huán)氧活化Sepharose 6B微珠（ECH beads），作為一種親和工具，用于分離可直接與ECH相互作用的蛋白。隨后采用考馬斯亮藍染色和液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）對捕獲蛋白進行可視化和鑒定。值得注意的是，在鑒定到的蛋白中，HSC70的豐度最高。因此，我們推測HSC70可能是ECH的直接細胞靶點。進一步實驗顯示，HSC70可被ECH beads拉下，而過量游離ECH可競爭性抑制這一相互作用。此外，在另一篇已接收但尚未發(fā)表的文章中，我們已通過細胞熱遷移實驗、藥物親和反應靶點穩(wěn)定性實驗、生物層干涉技術等方法證實ECH能夠直接結合HSC70。

隨后，我們對HSC70-ECH復合物進行了1000 ns分子動力學（MD）模擬，以評估其穩(wěn)定性、柔性和緊密性。采用均方根偏差（RMSD）評估HSC70-ECH復合物的結構穩(wěn)定性。RMSD分析顯示，HSC70-ECH復合物在約200 ns模擬后達到結構穩(wěn)定。通過分析氨基酸殘基的均方根波動（RMSF）評估殘基特異性柔性。RMSF結果顯示，HSC70的N端和C端區(qū)域具有更高的內在柔性。這些末端區(qū)域的動態(tài)波動可能在調控HSC70活性及其與ECH相互作用中發(fā)揮關鍵作用。采用回轉半徑（Rg）分析監(jiān)測HSC70-ECH復合物在模擬過程中的結構緊密性，其平均Rg值為2.52 nm。由于氫鍵對于穩(wěn)定受體-配體復合物至關重要，因此分析了HSC70與ECH之間的氫鍵。結果顯示，模擬過程中氫鍵數(shù)量逐漸增加，提示結合穩(wěn)定性增強。為量化結合親和力，采用MM/PBSA方法進行分析。ECH-HSC70復合物的結合能為?36.59 kcal/mol，表明二者之間存在強相互作用。此外，殘基特異性能量分解分析鑒定出14個參與ECH結合的氨基酸殘基。綜上，這些結果證實ECH可直接結合HSC70并形成穩(wěn)定復合物。

HSC70的ARG36和ARG272氨基酸被鑒定為ECH的結合位點

殘基特異性能量分解分析顯示，有14個氨基酸殘基參與ECH結合，其中ARG36和ARG272是主要貢獻殘基。為驗證這一結果，我們采用丙氨酸掃描突變，將關鍵殘基ASN35、ARG36、ASP53、GLU231、THR265、ARG272和ASN364替換為丙氨酸。上述位點突變顯著削弱了HSC70-ECH復合物的整體穩(wěn)定性、柔性和緊密性，其中ARG36/ARG272雙突變的影響最為明顯。這些特定位點突變還破壞了氫鍵形成，并提高了復合物能量和結合能，提示結合親和力減弱。綜上，MD模擬表明HSC70能夠與ECH形成穩(wěn)定復合物，其中ARG36和ARG272是高親和力結合所必需的關鍵殘基。

HSC70在OP模型和臨床患者樣本中高表達

為闡明HSC70在OP中的潛在功能，我們檢測了HSC70在OP細胞模型、動物模型和患者樣本中的表達。qRT-PCR分析顯示，在RANKL誘導的破骨細胞生成過程中，Hsc70 mRNA水平自第3天起顯著上調。同時，WB分析顯示HSC70蛋白水平在破骨細胞生成過程中升高。與此一致，我們在OVX大鼠和OP患者的骨組織中均觀察到HSC70水平升高。此外，與健康個體相比，OP患者血漿HSC70水平顯著升高。總體而言，這些結果表明HSC70表達在OP中發(fā)生失調，藥理學抑制HSC70可能是一種可行的OP治療策略。

敲低HSC70抑制破骨細胞生成

為闡明HSC70在破骨細胞生成中的功能作用，我們使用強效HSC70抑制劑VER-155008處理RAW 264.7細胞。結果一致顯示，VER-155008處理可抑制RANKL誘導的破骨細胞生成相關基因表達。隨后，我們研究了Hsc70敲低對RANKL刺激下RAW 264.7細胞破骨細胞生成的影響。Hsc70敲低顯著阻礙了TRAP陽性多核破骨細胞的形成。此外，qRT-PCR分析顯示，Hsc70缺失削弱了破骨細胞生成相關基因的激活。F-actin染色結果顯示，Hsc70敲低阻斷了F-actin環(huán)形成。同時，Hsc70敲低抑制了破骨細胞的骨吸收活性。綜上，這些結果表明Hsc70敲低可抑制破骨細胞生成。

HSC70通過IKKβ-NF-κB軸調控破骨細胞生成

鑒于RANKL激活的NF-κB信號對破骨細胞生成至關重要，我們分析了RANKL刺激并經(jīng)ECH處理的RAW 264.7細胞中的NF-κB信號活性。ECH有效阻斷了RANKL誘導的NF-κB轉錄活化，并阻止NF-κB p65核轉位。類似地，VER-155008處理也抑制了RANKL觸發(fā)的NF-κB p65核轉位。值得注意的是，ECH和VER-155008均不影響總NF-κB p65蛋白水平。此外，Hsc70敲低同樣不改變NF-κB p65蛋白水平，但可阻止RANKL誘導的NF-κB p65入核。

進一步研究顯示，ECH處理降低了IKKβ蛋白水平，從而導致RANKL處理細胞中IκBα磷酸化水平下降。Hsc70敲低同樣降低IKKβ表達，并進一步減少IκBα磷酸化。此外，ECH處理和Hsc70敲低均促進IKKβ降解。蛋白酶體抑制劑MG-132的使用可消除ECH誘導的IKKβ降解，說明該降解過程通過蛋白酶體途徑發(fā)生，并伴隨IKKβ泛素化增加。類似地，HSC70敲低也增加了IKKβ泛素化和降解。綜上，這些數(shù)據(jù)表明HSC70通過IKKβ-NF-κB軸調控破骨細胞生成。

ECH靶向HSC70緩解卵巢切除大鼠模型中的OP

為證明ECH在體內通過靶向HSC70抑制破骨細胞生成，我們建立了卵巢切除（OVX）誘導的OP大鼠模型和Hsc70過表達OVX大鼠模型（OVX+AAV9-Hsc70），并通過灌胃給予ECH處理10周。AAV9介導的Hsc70過表達通過OVX大鼠膝關節(jié)腔注射實現(xiàn)。ECH劑量依據(jù)既往研究設定。與Sham組相比，OVX組體重顯著升高。ECH處理輕度減弱了這種體重增加，而OVX大鼠中Hsc70過表達對體重無顯著影響。

Micro-CT分析顯示，與Sham+AAV9-Vector組相比，OVX+AAV9-Vector組的BMD、骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和連接密度（Conn.D）顯著降低，而結構模型指數(shù)（SMI）升高，表現(xiàn)出典型OP病理特征。ECH處理顯著改善BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Conn.D，并降低SMI。然而，Hsc70過表達消除了ECH的這些治療作用。

骨特異性堿性磷酸酶（BALP）和Ⅰ型前膠原N端前肽（PINP）是典型骨形成生物標志物，而Ⅰ型膠原C端交聯(lián)肽（CTX-1）是骨吸收生物標志物。進一步結果顯示，OVX組血清PINP降低，而BALP和CTX-1升高。ECH可逆轉這些變化，但Hsc70過表達阻斷了ECH介導的PINP、BALP和CTX-1水平恢復。H&E染色和TRAP染色顯示，ECH改善骨微結構并抑制破骨細胞生成，而Hsc70過表達抵消了ECH對TRAP陽性破骨細胞的抑制作用。值得注意的是，單獨Hsc70過表達即可在正常大鼠中誘導骨丟失。綜上，這些數(shù)據(jù)表明，ECH通過靶向HSC70緩解OVX大鼠模型中的OP。

Hsc70敲低緩解卵巢切除大鼠模型中的OP

為探討Hsc70沉默對骨表型及ECH體內治療作用的影響，我們建立了OVX誘導的OP大鼠模型和Hsc70敲低OVX大鼠模型，并通過灌胃給予ECH處理10周。AAV9介導的Hsc70敲低通過大鼠膝關節(jié)腔注射實現(xiàn)。體重結果顯示，與NC shRNA+OVX組相比，Hsc70 shRNA+OVX組大鼠體重顯著降低，提示Hsc70敲低減輕了OVX誘導的大鼠體重增加。此外，Hsc70 shRNA+OVX組與Hsc70 shRNA+OVX+ECH組之間體重無顯著差異，說明Hsc70敲低消除了ECH對大鼠體重的影響。

Micro-CT分析顯示，與NC shRNA+OVX組相比，Hsc70 shRNA+OVX組的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Conn.D顯著升高，而骨小梁分離度（Tb.Sp）降低，表明Hsc70敲低可緩解OVX誘導的骨丟失和OP表型。然而，Hsc70敲低完全抵消了ECH在OVX大鼠中的治療作用。H&E染色和TRAP染色顯示，Hsc70敲低改善骨微結構并抑制破骨細胞生成。同時，Hsc70敲低破壞了ECH對骨微結構的有益作用及其對破骨細胞生成的抑制作用。綜上，這些結果表明，Hsc70敲低可顯著減輕OVX大鼠的骨丟失。

圖1. HSC70是ECH的細胞靶點。
（A）松果菊苷（ECH）的化學結構。（B）ECH處理48 h和72 h后對RAW 264.7細胞活力的影響，n=4。（C-D）RANKL刺激的RAW 264.7細胞經(jīng)ECH處理7天后的TRAP染色圖像及破骨細胞生成定量分析。比例尺，500 μm；n=3。（E-H）qRT-PCR分析RANKL刺激的RAW 264.7細胞經(jīng)ECH處理72 h后Nfatc1、Ctsk、c-Fos和Acp5的mRNA水平，n=3。（I-J）RANKL刺激的RAW 264.7細胞經(jīng)ECH處理7天后的F-actin染色圖像及F-actin環(huán)定量分析。比例尺，200 μm；n=3。（K-L）RANKL刺激的RAW 264.7細胞經(jīng)ECH處理10天后的骨吸收陷窩圖像及陷窩面積定量分析。比例尺，200 μm；n=3。（M）ECH pull-down實驗的代表性凝膠圖像，n=3。（N）LC-MS/MS在RAW 264.7細胞中篩選出的前八個潛在ECH結合蛋白。（O）Pull-down實驗驗證ECH與RAW 264.7細胞中HSC70的結合，n=3。（P）RMSD分析反映HSC70-ECH復合物的結構穩(wěn)定性。（Q）RMSF分析顯示HSC70-ECH復合物的殘基特異性柔性。（R）Rg分析評估HSC70-ECH復合物的結構緊密性。（S）模擬過程中HSC70與ECH之間的氫鍵數(shù)量。（T）MM/PBSA計算得到的HSC70-ECH復合物結合自由能。（U）HSC70-ECH相互作用的殘基能量分解。TDC：總分解貢獻；SDC：側鏈分解貢獻；BDC：骨架分解貢獻。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。***p<0.001，**p<0.01。ns，差異無統(tǒng)計學意義。

圖2. HSC70的ARG36和ARG272氨基酸被鑒定為ECH的結合位點。
（A）HSC70突變體-ECH復合物的RMSD分析。（B）HSC70突變體-ECH復合物的RMSF分析。（C）HSC70突變體-ECH復合物的Rg分析。（D）HSC70突變體與ECH之間的氫鍵數(shù)量。（E）HSC70突變體-ECH復合物的能量分析。（F）HSC70突變體-ECH復合物的結合自由能分析。

圖3. HSC70在OP模型和臨床患者樣本中高表達。
（A-C）通過qRT-PCR和WB定量檢測RAW 264.7細胞破骨細胞生成過程中HSC70的表達，n分別為3和3。（D-E）Sham和OVX大鼠脛骨切片中HSC70免疫組織化學代表性圖像及定量分析。比例尺，500 μm；n=3。每組定量分析5張圖像。（F）健康對照（n=1）和OP患者（n=1）股骨切片的H&E染色及HSC70免疫組織化學代表性圖像。比例尺，5 mm。（G）健康對照（n=29）和OP患者（n=29）血漿HSC70水平。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。ns，差異無統(tǒng)計學意義。

圖4. Hsc70敲低抑制破骨細胞生成。
（A-B）TRAP染色顯示，在RANKL刺激7天后，Hsc70敲低的RAW 264.7細胞中破骨細胞形成減少。比例尺，500 μm；n=3。（C-G）qRT-PCR分析RANKL刺激72 h后Hsc70敲低RAW 264.7細胞中Nfatc1、Ctsk、c-Fos和Acp5的mRNA水平，n=3。（H-I）RANKL刺激7天后Hsc70敲低RAW 264.7細胞的F-actin染色圖像及F-actin環(huán)定量分析。比例尺，200 μm；n=3。（J-K）RANKL刺激10天后Hsc70敲低RAW 264.7細胞的骨吸收陷窩圖像及陷窩面積定量分析。比例尺，200 μm；n=3。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

圖5. HSC70通過IKKβ-NF-κB軸調控破骨細胞生成。
（A）WB分析RANKL刺激的RAW 264.7細胞經(jīng)ECH處理8 h后核內和胞質NF-κB p65蛋白水平，n=3。（B）免疫熒光染色及定量分析RANKL刺激的RAW 264.7細胞經(jīng)ECH處理8 h后的NF-κB p65核轉位。比例尺，25 μm。（C）RANKL刺激8 h后Hsc70敲低RAW 264.7細胞中核內和胞質NF-κB p65蛋白水平，n=3。（D）免疫熒光染色及定量分析RANKL刺激8 h后Hsc70敲低RAW 264.7細胞中的NF-κB p65核轉位。比例尺，25 μm。（E）WB分析RANKL刺激的RAW 264.7細胞經(jīng)ECH處理8 h后IKKβ和p-IκBα水平，n=3。（F）RANKL刺激8 h后Hsc70敲低RAW 264.7細胞中IKKβ和p-IκBα蛋白水平，n=3。（G）293T細胞經(jīng)ECH（20 μM）處理不同時間后進行環(huán)己酰亞胺（CHX，50 μg/ml）追蹤實驗，并通過WB分析IKKβ蛋白水平，n=3。（H）Hsc70敲低RAW 264.7細胞經(jīng)10 μg/ml CHX處理不同時間后IKKβ降解動力學，通過WB分析IKKβ蛋白水平，n=3。（I）RAW 264.7細胞先經(jīng)MG-132處理，再暴露于ECH 8 h，檢測并定量IKKβ相對蛋白水平，n=3。（J）293T細胞轉染Myc-IKKβ和HA-Ub質粒48 h后，經(jīng)ECH處理24 h并經(jīng)MG-132處理8 h，進行共免疫沉淀實驗。泛素化IKKβ用抗Myc微珠免疫沉淀，并用抗HA抗體檢測，n=3。（K）293T細胞轉染Myc-IKKβ和HA-Ub質粒24 h后，再轉染靶向HSC70的siRNA 48 h，并經(jīng)MG-132處理8 h，進行共免疫沉淀實驗。泛素化IKKβ用抗Myc微珠免疫沉淀，并用抗HA抗體檢測，n=3。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。ns，差異無統(tǒng)計學意義。

圖6. ECH靶向HSC70緩解卵巢切除大鼠模型中的OP。
（A）AAV9介導Hsc70遞送及ECH處理OVX大鼠的實驗設計。（B）各實驗組大鼠體重監(jiān)測，n=7/組。（C）各實驗組大鼠股骨代表性micro-CT圖像及三維重建圖，n=5/組。（D-I）基于C圖的骨小梁組織形態(tài)計量學分析：BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、SMI和Conn.D，n=5/組。（J-L）各實驗組大鼠血清PINP、BALP和CTX-1水平，n=6/組。（M）各實驗組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色代表性圖像。黑色箭頭表示TRAP陽性細胞。比例尺分別為200 μm和100 μm；n=3/組。（N）各實驗組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色圖像定量分析。每組定量分析5張圖像。（O-P）各實驗組大鼠脛骨切片HSC70免疫組織化學代表性圖像及定量分析。比例尺，500 μm；n=3/組。每組定量分析5張圖像。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。ns，差異無統(tǒng)計學意義。

圖7. Hsc70過表達誘導正常大鼠骨丟失。
（A）AAV9介導Hsc70過表達與空載體（AAV9-Vector）在大鼠中的實驗設計。（B）對照組（Vector）和Hsc70過表達組股骨代表性micro-CT圖像及三維重建圖，n=3/組。（C-H）基于B圖的骨小梁組織形態(tài)計量學分析：BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和SMI，n=3/組。（I）AAV9-Vector組和AAV9-Hsc70組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色代表性圖像。黑色箭頭表示TRAP陽性細胞。比例尺分別為200 μm和100 μm；n=3/組。（J）AAV9-Vector組和AAV9-Hsc70組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色圖像定量分析。每組定量分析5張圖像。（K-L）AAV9-Vector組和AAV9-Hsc70組大鼠脛骨切片HSC70免疫組織化學代表性圖像及定量分析。比例尺，500 μm；n=3/組。每組定量分析5張圖像。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

圖8. Hsc70敲低緩解卵巢切除大鼠模型中的OP。
（A）AAV9介導Hsc70 shRNA遞送及ECH處理OVX大鼠的實驗設計。（B）各實驗組大鼠體重監(jiān)測，n=7/組。（C）各實驗組大鼠股骨代表性micro-CT圖像及三維重建圖，n=5/組。（D）基于C圖的骨小梁組織形態(tài)計量學分析：BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和Conn.D，n=5/組。（E）各實驗組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色代表性圖像。黑色箭頭表示TRAP陽性細胞。比例尺分別為200 μm和100 μm；n=5/組。（F）各實驗組大鼠脛骨切片H&E和TRAP染色圖像定量分析。每組定量分析5張圖像。（G-H）各實驗組大鼠脛骨切片HSC70免疫組織化學代表性圖像及定量分析。比例尺，500 μm；n=5/組。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。ns，差異無統(tǒng)計學意義。

圖9. ECH通過抑制HSC70介導破骨細胞生成的機制示意圖。

【Citation】:Han D, Wu QT, Wang L, Li JG, Li P, Li F. Echinacoside targets HSC70 to inhibit osteoclastogenesis and ameliorate ovariectomy-induced osteoporosis.Phytomedicine. Published online April 10,2026.

【貢獻】★★★★★

綜上，本研究鑒定HSC70為ECH的直接細胞靶點。值得注意的是，HSC70在OP中病理性上調，并通過調控IKKβ的泛素化介導降解正向調節(jié)破骨細胞生成。此外，ECH靶向HSC70可在體內有效減輕骨丟失。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)為OP提供了潛在治療靶點，并鑒定ECH是一種新的HSC70抑制劑，在OP治療中具有重要轉化潛力。

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