2026年4月16日，中南大學湘雅二醫院代謝內分泌科胡芳團隊聯合溫州醫科大學附屬第一醫院鄭明華團隊等，在Metabolism （中科院1區，IF=11.9）在線發表題為 “Hepatocyte DDIT4 aggravates MASH progression through GPX4-mediated ferroptosis” 的研究論文。該研究聚焦代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）進展過程中肝細胞鐵死亡的關鍵調控機制，首次系統揭示 DDIT4通過抑制GPX4表達及其線粒體轉運，促進肝細胞鐵死亡，從而加重MASH脂質沉積、炎癥反應和肝纖維化進展，為MASH治療提供了新的潛在分子靶點。

▼編者按:

MASH是代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）的進展形式，可進一步發展為肝硬化甚至肝癌。盡管目前已有藥物獲得FDA有條件批準用于伴纖維化的成人MASH患者，但MASH的有效治療手段仍然有限，尋找安全、精準的新型干預靶點具有重要臨床意義。該研究從公共轉錄組數據庫和鐵死亡相關基因數據庫入手，篩選出與MASH和鐵死亡高度相關的核心分子DDIT4，并在MASH患者肝組織、MASH小鼠模型以及脂肪酸誘導的肝細胞模型中驗證其顯著上調。

研究發現，DDIT4表達水平與MASH嚴重程度、肝損傷指標以及鐵死亡標志物呈正相關。進一步通過肝細胞特異性DDIT4過表達和敲除小鼠模型，作者證明DDIT4并非單純的伴隨性變化，而是MASH進展的重要推動因素。DDIT4過表達會顯著加重肝臟脂質沉積、炎癥浸潤、肝損傷和纖維化；相反，抑制或敲除DDIT4則能夠緩解MASH病理進展。

機制上，該研究揭示了一個關鍵的 DDIT4—GPX4—鐵死亡軸。GPX4是抑制鐵死亡的重要抗氧化酶，而DDIT4一方面通過抑制mTORC1信號降低GPX4蛋白表達，另一方面又可與胞質中的GPX4發生相互作用，并干擾TOM22介導的GPX4線粒體轉運，導致線粒體GPX4減少，最終增強脂質過氧化和鐵死亡敏感性。換言之，DDIT4通過“雙重打擊”削弱GPX4的抗鐵死亡防線，使肝細胞更容易發生鐵死亡，從而推動MASH惡化。

更具轉化意義的是，研究團隊通過分子對接和表面等離子體共振實驗篩選并驗證天然黃酮類化合物 Quercetagetin 可作為潛在DDIT4靶向化合物。動物實驗顯示，Quercetagetin干預能夠緩解MASH小鼠的肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，提示DDIT4不僅是MASH進展機制中的關鍵節點，也可能成為未來MASH藥物開發的重要靶點。

總體而言，該研究從“鐵死亡驅動MASH進展”這一核心科學問題出發，系統闡明了肝細胞DDIT4在GPX4調控、線粒體抗氧化防御和鐵死亡激活中的關鍵作用，提出 靶向DDIT4阻斷鐵死亡 可能是干預MASH進展的新策略。該成果不僅豐富了MASH發生發展的分子機制，也為天然產物靶向治療MASH提供了新的理論依據和實驗支撐。

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【摘要】

背景與目的：代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）是一種進展性肝病，目前治療選擇有限；鐵死亡在其發病機制中的作用仍有待充分闡明。本研究旨在探究 DNA 損傷誘導轉錄物 4（DDIT4）在鐵死亡以及 MASH 進展調控中的作用。

方法：研究利用 MASH 小鼠模型的 Gene Expression Omnibus 數據庫和鐵死亡數據庫，篩選 MASH 中關鍵的鐵死亡相關基因；在 MASH 患者、小鼠模型和肝細胞中檢測肝臟 DDIT4 表達；在不同飲食誘導的 MASH 小鼠模型中，通過肝細胞特異性 DDIT4 過表達或敲除評估 DDIT4 的功能作用；采用 RNA 測序和免疫沉淀-質譜（IP-MS）確定 DDIT4 的相互作用蛋白；并通過分子對接探索可能靶向 DDIT4 的化合物。

結果：研究發現，MASH 小鼠和患者中的 DDIT4 水平均顯著升高，并且與 MASH 嚴重程度呈正相關。肝細胞特異性 DDIT4 過表達會加重鐵死亡和 MASH 進展，而 DDIT4 缺失則緩解鐵死亡和 MASH 進展。機制上，DDIT4 以 mTORC1 依賴方式降低谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）的表達。此外，DDIT4 與胞質 GPX4 相互作用，并抑制 TOM22 介導的 GPX4 向線粒體轉位，導致線粒體 GPX4 減少并激活鐵死亡。重要的是，研究通過分子對接和表面等離子體共振（SPR）鑒定出天然黃酮類化合物槲皮萬壽菊素（quercetagetin，QG）是潛在的 DDIT4 靶向化合物。給予 QG 能夠緩解 MASH 小鼠的肝脂肪變、炎癥和纖維化。

結論：本研究確立了 DDIT4-GPX4-鐵死亡軸是 MASH 進展中的一個新的調控節點，并提示 DDIT4 可能成為 MASH 的潛在治療靶點 。

01

研究背景及科學問題

代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）是全球最常見的慢性肝病之一。其進展形式——代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）——可導致肝硬化和肝癌等嚴重后果，給全球醫療衛生與經濟系統造成重大負擔[1–3]。瑞美替羅（Resmetirom）是一種 THR-β 受體激動劑[4]，目前是唯一獲得美國 FDA 有條件批準、用于治療伴有肝纖維化的成人 MASH 患者的藥物。然而，其具體療效和安全性仍需通過更大規模臨床研究進一步驗證。因此，識別安全且有效的 MASH 治療靶點至關重要。

從脂肪變性向 MASH 的轉變始于肝細胞死亡，隨后觸發炎癥和纖維化[5]。盡管在 MASH 進展過程中，凋亡、壞死性凋亡、焦亡和鐵死亡等多種細胞死亡形式并存，但其中占主導地位的機制仍不清楚[6,7]。值得注意的是，鐵死亡被定義為鐵依賴性脂質過氧化過程[8]，越來越多證據提示其是 MASH 發病機制中的早期事件[9,10]；同時，鐵死亡抑制劑已被證明能夠緩解 MASH 模型中的疾病病理改變[11,12]。

除 Fe2+ 過載可催化多不飽和脂肪酸（PUFA）過氧化外，氧化還原代謝改變也會從根本上提高細胞對鐵死亡的敏感性。線粒體產生的活性氧（ROS）增加會觸發肝臟脂質過氧化，該過程可在內質網膜中擴散，并最終到達質膜[13,14]。谷胱甘肽（GSH）-硒酶谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）系統是一種關鍵的硫醇依賴性細胞抗氧化系統。GSH 生物合成以及 GPX4 的正常功能能夠保護細胞免于多種氧化應激條件所誘發的死亡，尤其是可導致硫醇耗竭的應激條件[15]。由于 GPX4 具有還原復雜氫過氧化物、從而中斷脂質過氧化鏈式反應的獨特能力，它已被確立為癌細胞鐵死亡的關鍵上游調節因子[16]。GPX4 的蛋白降解、基因敲除或化學抑制均可在多種細胞中促進鐵死亡[17]。近期研究報道，GPX4 活性降低可促進 MASLD 中的鐵死亡[18]；線粒體中 GPX4 降解會觸發鐵死亡，導致肝損傷和肝纖維化加重[19]；相反，GPX4 過表達則能夠緩解 MASH[20]。盡管現有研究提示氧化還原狀態和關鍵酶 GPX4 將鐵死亡與 MASH 聯系起來，但在 MASH 中調控鐵死亡的具體蛋白仍缺乏充分表征。

本研究通過整合分析鐵死亡數據集和 MASH 模型 RNA 測序數據，鑒定出 DNA 損傷誘導轉錄物 4（DDIT4）是 MASH 進展的關鍵調控因子。DDIT4 在人類 MASH 樣本以及嚙齒動物細胞和動物模型中表達升高，并通過靶向 GPX4 促進鐵死亡，進而導致肝臟脂質積累、炎癥和纖維化增加。遺傳學或藥理學抑制肝臟 DDIT4 均可緩解 MASH。本研究揭示了 GPX4 的一個新的調控因子，并提示 DDIT4 可能是 MASH 的潛在治療靶點。

02

重要發現及亮點

3.1 DDIT4 在 MASH 中顯著上調，并與 MASH 進展相關

為尋找參與鐵死亡并調控 MASH 進展的潛在分子，研究首先檢索了公開可獲得的 MASH 小鼠模型肝臟轉錄組數據。由于 MASH 可由不同飲食或化學因素誘導[23]，研究從 GEO 數據庫中選擇了 5 個數據集（GSE197322、GSE35961、GSE207856、GSE200352 和 GSE162863），這些數據集代表了不同飲食、化學誘導方式或不同處理時長所誘導的 MASH 模型；隨后分析其共同差異表達基因（DEGs）。最終，在 5 個數據庫中鑒定出 17 個與 MASH 高度相關的樞紐基因（圖 1A）。

為進一步篩選與鐵死亡相關的基因，研究從鐵死亡數據庫 FerrDb（zhounan.org/ferrdb）中獲得 564 個鐵死亡相關基因。將上述 17 個樞紐基因與鐵死亡基因進一步取交集后，最終鑒定出 4 個基因（Nupr1、Ddit4、Plin4 和 Stmn1）（圖 1A）。其中 Nupr1（核蛋白 1）已被證明是鐵死亡抑制因子[24]，而另外 3 個基因在鐵死亡和 MASH 中的作用尚不清楚。基于已發表數據[25]，研究發現僅 Ddit4 在鐵死亡誘導劑 Erastin 刺激后顯著上調。

DDIT4（DNA damage-induced transcript 4，基因名 Ddit4；亦稱 REDD1 或 RTP801）是一種高度保守的蛋白，可由多種細胞應激因素誘導，例如缺氧、DNA 損傷、電離輻射、內質網應激和熱休克[26,27]。然而，其在 MASH 中的作用仍不清楚。

為首先明確 DDIT4 在鐵死亡和 MASH 中的臨床相關性，研究收集了原發疾病為肝內膽管結石、肝囊腫或肝血管瘤患者的肝組織。根據 NAFLD 活動度評分（NAS），將患者分為 MASH 組和非 MASH 組。研究通過免疫組織化學（IHC）分析評估患者肝臟中 DDIT4 和 4-羥基壬烯醛（4-HNE，鐵死亡標志物）的蛋白水平。結果顯示，MASH 組中 DDIT4（圖 1B-C）和 4-HNE 均顯著上調（補充圖 S1A-B）。值得注意的是，DDIT4 與 4-HNE 呈強正相關（補充圖 S1C）。DDIT4 陽性區域還與 NAS 評分以及 γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）和丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平呈正相關（圖 1D），后兩者均為肝損傷相關酶。此外，對 29 例患者肝樣本的分析顯示，Ddit4 mRNA 表達與血清 ALT、AST 和甘油三酯（TG）水平呈顯著正相關（圖 1E）。綜上，DDIT4 表達升高與患者肝損傷、鐵死亡和 MASH 進展加重相關。

為進一步驗證 DDIT4 在嚙齒動物 MASH 發展中的變化，研究檢測了 MASH 動物模型肝臟中的 DDIT4 蛋白表達。Gubra-Amylin NASH（GAN）飲食含有飽和脂肪（40%）、果糖（22%）和膽固醇（2%），以 GAN 飲食喂養的動物可代表纖維化性 MASH 模型[28]。數據顯示，與普通飼料（NC）喂養小鼠相比，GAN 飲食誘導的肥胖小鼠肝臟 DDIT4 蛋白水平顯著升高（圖 1F）。此外，與各自野生型（WT）對照小鼠相比，db/db 和 ob/ob 小鼠肝臟中 DDIT4 表達也顯著升高（圖 1G-H）。

為闡明 Ddit4 在肝臟不同細胞中的表達模式，研究重新分析了公開可獲得的單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）數據集（GSE166504），該數據集包含對照、MAFL 和 MASH 小鼠模型的肝樣本。研究發現，在對照條件下，Ddit4 在肝細胞中的表達較低，但在 MAFL 和 MASH 中顯著升高（補充圖 S1D-E）。星狀細胞中也出現了類似表達模式。相反，Kupffer 細胞中的 Ddit4 水平在對照組較高，而在 MAFL 和 MASH 中顯著下降（補充圖 S1D-E）。這些數據表明，小鼠肝臟中 Ddit4 具有與 MASH 進展相關的細胞特異性表達模式。

此外，體外實驗顯示，在棕櫚酸（PA）和油酸（OA）處理原代肝細胞所誘導的 MASH 細胞模型中，DDIT4 表達顯著上調（圖 1I）。綜合來看，DDIT4 是一種與 MASH 和鐵死亡相關的蛋白，升高的 DDIT4 可能參與 MASH 進展。

圖 1. DDIT4 表達在 MASH 中顯著上調，并與 MASH 進展相關。A. 將 DDIT4 鑒定為 MASH 和鐵死亡中的核心基因。B. 非 MASH 與 MASH 個體肝切片中 DDIT4 IHC 染色的代表性顯微圖像。C. 對所示個體肝切片中 DDIT4 IHC 染色的定量分析（n = 12/組）。D. DDIT4 表達與 NAS 評分、血清 ALT 和 GGT 水平的相關性分析。E. MASH 患者和健康對照中 Ddit4 mRNA 表達與 NAS 評分、血清 ALT、AST 和 TG 水平的相關性分析。F. GAN 飲食誘導 MASH 小鼠和普通飼料（NC）喂養小鼠肝臟中 DDIT4 蛋白表達（n = 5-6 只/組）。G. db/db 小鼠和野生型（WT）小鼠肝臟中 DDIT4 蛋白表達（n = 5 只/組）。H. ob/ob 小鼠和 WT 小鼠肝臟中 DDIT4 蛋白表達（n = 5 只/組）。I. PAOA 或 BSA 處理原代肝細胞中 DDIT4 蛋白表達（n = 3/組）。數據表示為均值 ± SEM，****p < 0.0001。兩組比較采用雙尾 Student t 檢驗。

3.2 肝細胞特異性 DDIT4 過表達加重 GAN 飲食誘導的 MASH

為研究肝臟 DDIT4 在體內的作用，研究利用 CRISPR-Cas9 技術和白蛋白-Cre 系統構建了肝細胞特異性 DDIT4 敲入小鼠（DDIT4 LKI）（補充圖 S2A-B）。Western blot 分析驗證 DDIT4 表達僅在肝臟中特異性升高，而不影響其他組織（補充圖 S2C）。研究首先考察了在 NC 飲食條件下，肝臟特異性 DDIT4 過表達對小鼠代謝表型的影響。與同窩對照（DDIT4 FLOX）小鼠相比，DDIT4 LKI 小鼠的體重、肝重、葡萄糖耐量試驗（GTT）和胰島素耐量試驗（ITT）均無顯著差異（補充圖 S2D-F）。血清 TG、總膽固醇（TC）含量以及血清 ALT 和 AST 水平也無差異（補充圖 S2G-H），提示在正常營養條件下，肝細胞 DDIT4 過表達不影響小鼠的生理功能及全身糖脂代謝。

為探索肝細胞 DDIT4 在 MASH 中的作用，研究用 GAN 飲食喂養 LKI 小鼠和 FLOX 對照小鼠（補充圖 S2I）。在 16 周喂養期間，兩組小鼠體重無顯著差異（補充圖 S2J），但與對照組相比，LKI 組肝重以及肝重/體重比顯著升高（圖 2D-E）。此外，GTT 和 ITT 結果顯示，LKI 小鼠葡萄糖耐量受損更嚴重，胰島素敏感性更差（圖 2A-B），提示肝細胞 DDIT4 過表達加重了 MASH 小鼠的糖代謝異常。

就肝臟而言，根據 H&E 染色和油紅 O 染色的組織學評估，LKI 小鼠表現出更嚴重的脂肪變性或脂質積累（圖 2C）。研究分別采用 F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色檢測肝臟炎癥和膠原纖維沉積，結果顯示 LKI 小鼠肝臟炎癥和纖維化更嚴重（圖 2C）。同時，與對照小鼠相比，LKI 小鼠血清（圖 2F-G）和肝臟（圖 2H-I）TG 與 TC 水平均顯著升高。此外，LKI 小鼠血清 ALT 和 AST 水平也較對照組升高（圖 2J-K）。總體而言，肝細胞 DDIT4 過表達會加重 GAN 飲食誘導的 MASH 小鼠模型中的肝臟脂質積累、炎癥和纖維化。

為進一步探索肝細胞 DDIT4 過表達導致的轉錄組變化，研究在 GAN 飲食喂養 16 周后提取 LKI 和 FLOX 小鼠肝組織進行 RNA 測序（RNA-seq）。聚類分析和主成分分析（PCA）顯示，FLOX 組和 LKI 組之間存在顯著差異（補充圖 S2K-L）。兩組之間共有 184 個差異表達基因，其中 128 個上調、56 個下調（補充圖 S2M）。為明確 DDIT4 過表達改變了哪些通路，研究進行了基因集富集分析（GSEA），結果顯示 LKI 小鼠中脂質代謝、炎癥和纖維化相關通路顯著富集（圖 2L）。同時，介導上述通路變化的核心基因在 LKI 小鼠中均升高（圖 2M）。實時 qPCR 驗證顯示，與脂質轉運和脂質合成相關的基因（Lipin3、Gpat3、Cd36 和 Fasn）、促炎基因（Bcl2、Il1b、Ccl6 和 Cxcl16）以及促纖維化基因（a-Sma、Col1a1、Timp1 和 Tgfb）的 mRNA 水平均在 LKI 小鼠中顯著上調（圖 2N-P）。總體而言，肝臟特異性 DDIT4 過表達可加重 GAN 飲食誘導的 MASH。

圖 2. 肝細胞特異性 DDIT4 過表達加重 GAN 誘導的 MASH。肝細胞特異性 DDIT4 過表達小鼠（LKI）和對照（FLOX）小鼠接受 GAN 飲食喂養 16 周。A. 葡萄糖耐量試驗（GTT）及 GTT 曲線下面積（AUC）（n = 6 只/組）。B. 胰島素耐量試驗（ITT）及 ITT 的 AUC（n = 6 只/組）。C. LKI 和 FLOX 小鼠肝臟 H&E 染色、油紅 O 染色、F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色的代表性顯微圖像；柱狀圖為相應染色陽性區域的統計分析（n = 4/組）。D-E. 肝重及肝重/體重比（n = 6 只/組）。F-G. 血清 TG 和 TC 水平（n = 6 只/組）。H-I. 肝臟 TG 和 TC 水平（n = 6 只/組）。J-K. 血清 AST 和 ALT 水平（n = 6 只/組）。L. 與脂質代謝、炎癥和纖維化相關通路的 GSEA 富集分析。M. 所示組別中與脂質代謝、炎癥和纖維化相關基因的熱圖。N-P. 所示組別中與脂質代謝、炎癥和纖維化相關基因的 mRNA 水平（n = 3/組）。數據表示為均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。兩組比較采用雙尾 Student t 檢驗。

3.3 肝細胞特異性 DDIT4 過表達加重 HFMCD 誘導的 MASH

HFMCD 喂養是另一種常用的 MASH 動物模型飲食，可在短時間內造成嚴重肝損傷和纖維化[29]。為進一步確認 DDIT4 在 MASH 進展中的作用，研究給予 FLOX 和 LKI 小鼠 HFMCD 飲食 4 周（補充圖 S3A）。與 GAN 飲食誘導 MASH 模型中的觀察一致，LKI 小鼠和對照小鼠之間體重及肝重無顯著差異（補充圖 S3B-C）。與對照組相比，LKI 小鼠血清和肝臟 TG 均升高，而 TC 無差異（補充圖 S3D-G）。H&E 和油紅 O 染色結果顯示，LKI 小鼠肝臟脂質積累更嚴重（補充圖 S3H）。Sirius red 染色和 F4/80 染色結果（補充圖 S3H）以及血清 ALT 和 AST 水平（補充圖 S3I-J）顯示，LKI 小鼠肝纖維化和肝損傷更嚴重。類似地，與脂質代謝、促炎和促纖維化相關的基因 mRNA 水平顯著上調（補充圖 S3J）。綜上，肝細胞 DDIT4 過表達加重了 HFMCD 誘導 MASH 中的肝臟脂質積累、炎癥和纖維化。

3.4 DDIT4 在體內外促進肝臟鐵死亡易感性

由于肝細胞死亡是 MASH 進展中的關鍵事件，為確定 DDIT4 過表達肝細胞中發生的細胞死亡類型，研究從 FLOX 和 LKI 小鼠中分離原代肝細胞，并在 PAOA 處理同時加入不同細胞死亡抑制劑，包括凋亡抑制劑 Z-VAD-FMK（Z-VAD）、壞死性凋亡抑制劑 Necrostatin-1（Nec-1）和鐵死亡抑制劑 Ferrostatin-1（Fer-1）。細胞活力結果顯示，只有 Fer-1 能夠逆轉 DDIT4 過表達誘導的細胞死亡（圖 3A），提示 DDIT4 在肝細胞中誘導鐵死亡。為驗證這一點，研究隨后用不同濃度的鐵死亡誘導劑（RSL3 或 Erastin）處理 DDIT4 過表達（Ddit4 OE）原代肝細胞。結果顯示，與對照細胞相比，DDIT4 過表達肝細胞對 RSL3 處理表現出濃度依賴性的死亡率顯著升高（圖 3B）。Erastin 處理在最高使用劑量下也導致更高的死亡率（補充圖 S4A）。

線粒體形態改變以及脂質過氧化和 ROS 積累均與鐵死亡相關。研究檢測了 PAOA 處理下 DDIT4 過表達原代肝細胞的特征性變化。結果顯示，在電子顯微鏡下，DDIT4 過表達導致更明顯的線粒體萎縮，線粒體更濃縮、更短（圖 3C）；熒光 BODIPY581/591 C11 染色顯示脂質過氧化水平升高，同時線粒體 ROS（mitoSOX）和全細胞 ROS（DCFH-DA）水平均增加（圖 3D）。

此外，研究還確定肝細胞 DDIT4 過表達是否影響小鼠肝臟鐵死亡。研究檢測了 GAN 或 HFMCD 飲食喂養的 FLOX 和 LKI 小鼠肝臟中的肝內鐵含量、脂質過氧化產物丙二醛（MDA）含量以及還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值。結果顯示，與 GAN 飲食（圖 3E）或 HFMCD 飲食（圖 3F）喂養的對照小鼠相比，LKI 小鼠肝內鐵含量和 MDA 水平均顯著升高，而 GSH/GSSG 顯著降低，提示肝臟 DDIT4 過表達小鼠鐵死亡增加。綜合這些觀察結果可見，肝臟 DDIT4 過表達促進了 MASH 中的鐵死亡。

圖 3. DDIT4 在體內外促進肝臟鐵死亡易感性。A. 來自 FLOX（對照）或 DDIT4 LKI 小鼠（Ddit4 OE）的原代肝細胞，在 Nec-1、Z-VAD 或 Fer-1 存在下接受 BSA 或 PAOA 處理 24 h。采用 CCK8 法檢測細胞活力（n = 6/組）。B. 對照或 Ddit4 OE 原代肝細胞用 DMSO 或 RSL3 處理 6 h，采用 CCK8 法檢測細胞活力（n = 6/組）。C. BSA 或 PAOA 預處理后，對照和 Ddit4 OE 原代肝細胞中線粒體的代表性透射電鏡圖像；散點圖表示各組相應線粒體長度，數據為 3 個獨立生物學重復的均值 ± SEM，每組共分析 17 個線粒體。D. BSA 或 PAOA 預處理后，對照和 Ddit4 OE 原代肝細胞中 Bodipy 581/591 C11、DCFH-DA 和 MitoSOX 染色的代表性熒光顯微圖像；柱狀圖為陽性區域（A.U.）定量（n = 3/組）。E. GAN 飲食喂養 FLOX 或 LKI 小鼠肝臟鐵（Fe）含量、MDA 水平和 GSH/GSSG（n = 5-6 只/組）。F. HFMCD 飲食喂養 FLOX 或 LKI 小鼠肝臟 Fe 含量、MDA 水平和 GSH/GSSG（n = 5-6 只/組）。數據表示為均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns 表示無顯著性。兩組比較采用雙尾 Student t 檢驗，多組比較采用單因素 ANOVA 并進行 Tukey 事后檢驗。

3.5 DDIT4 通過促進鐵死亡加重脂質積累和炎癥

為確定 DDIT4 是否在肝細胞中誘導脂質積累和炎癥，研究從 FLOX 小鼠中分離原代肝細胞，并感染帶 Flag 標記的 DDIT4 表達腺病毒（Flag-Ddit4）或對照病毒（Flag-Vector），隨后進行 PAOA 處理。與 LKI 小鼠肝臟中的觀察一致，油紅 O 染色和細胞內 TG 含量檢測結果證實，在基礎狀態或 PAOA 處理下，DDIT4 過表達均會加重細胞內脂質積累（圖 4A-B）。研究還檢測了與脂質代謝和炎癥相關的基因，發現 DDIT4 過表達促進脂質合成基因（Srebf1、Fasn、Scd1 和 Pparg）以及促炎相關基因（Tnfa、Il1b 和 Il6）上調（圖 4C-D）。

為進一步明確鐵死亡是否介導 DDIT4 誘導的肝細胞脂質積累和炎癥，研究在 PAOA 條件下用鐵死亡抑制劑 Fer-1 處理 DDIT4 過表達肝細胞。油紅 O 染色結果顯示，Fer-1 處理降低了 DDIT4 過表達導致的脂質沉積（圖 4E-F），并降低脂質合成相關基因（Scd1、Pparg、Fasn 和 Srebf1）以及炎癥相關基因（Tnfa、Il1b 和 Il6）的表達（圖 4G-H）。綜上，這些結果表明，肝細胞 DDIT4 過表達會加重脂質積累和炎癥，而這一過程可能由鐵死亡促進所導致。

圖 4. DDIT4 通過促進鐵死亡加重脂質積累和炎癥。A. 原代肝細胞感染 Flag 標記的空載體（Flag-Vector）或 DDIT4 表達載體（Flag-Ddit4），隨后用 PAOA 或 BSA 處理；采用油紅 O 染色監測脂質積累。B. 肝細胞 TG 水平（n = 6/組）。C-D. 與脂質代謝和炎癥相關基因的相對 mRNA 表達（n = 3/組）。E. Ddit4 過表達（Flag-Ddit4）或對照（Flag-Vector）原代肝細胞經 PAOA 預處理后，再用 DMSO 或 Fer-1 處理；采用油紅 O 染色監測脂質積累。F. 肝細胞 TG 水平（n = 3/組）。G-H. 與脂質代謝和炎癥相關基因的相對 mRNA 表達（n = 3/組）。數據表示為均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns 表示無顯著性。兩組比較采用雙尾 Student t 檢驗，多組比較采用單因素 ANOVA 并進行 Tukey 事后檢驗。

3.6 DDIT4 通過抑制 GPX4 表達及其線粒體轉運促進鐵死亡

作為支架蛋白，DDIT4 通過與其他蛋白結合而發揮功能[30]。為研究肝細胞中 DDIT4 的相互作用蛋白，研究感染原代肝細胞使其表達 DDIT4，隨后在 PAOA 處理條件下通過免疫沉淀-質譜（IP-MS）篩選與 DDIT4 相互作用的蛋白。排除非特異性結合蛋白后，研究根據蛋白相互作用網絡分析富集蛋白。基因本體（GO）分析顯示，氧化還原酶活性是主要富集通路之一（補充圖 S5A），該通路包含 13 個候選蛋白（圖 5A）。

在候選蛋白中，只有 GPX4 是已知的經典鐵死亡抑制因子。研究使用共免疫沉淀（CO-IP）進一步驗證，在 PAOA 處理下，DDIT4 與原代肝細胞中的 GPX4 相互作用（圖 5B）。由于 DDIT4 和 GPX4 均可在細胞質和線粒體中表達，研究分離了 PAOA 處理肝細胞的胞質組分和線粒體組分，并進一步明確 DDIT4 與 GPX4 在胞質中相互結合，而不在線粒體中結合（圖 5C）。

為探索 DDIT4 如何調節肝細胞中的 GPX4，研究首先檢測了 GPX4 表達變化。結果顯示，DDIT4 過表達降低 GPX4 蛋白水平（圖 5D），但不降低其 mRNA 水平（補充圖 S5B）；而 DDIT4 沉默（通過 siRNA）顯著提高 GPX4 蛋白水平（圖 5E），提示存在潛在的翻譯后調控機制。為研究 DDIT4 是否影響 GPX4 穩定性，研究從 DDIT4 過表達肝細胞中分離胞質和線粒體組分，并進行環己酰亞胺（CHX）追蹤實驗。CHX 處理后，DDIT4 迅速降解，而 GPX4 穩定性明顯更高（補充圖 S5C）。值得注意的是，與對照組相比，DDIT4 過表達肝細胞的胞質或線粒體組分中 GPX4 降解速率均無顯著差異（補充圖 S5C）。結合此前報道 DDIT4 蛋白半衰期僅為 5 min[31]，這些結果共同提示 DDIT4 并不直接調節 GPX4 的穩定性。

既往研究報道 GPX4 蛋白水平受 mTORC1 信號調控[32]，而 DDIT4 是 mTORC1 信號的強效抑制因子[27]。因此，為研究 DDIT4 是否通過抑制 mTORC1 信號調節 GPX4 蛋白，研究采用 WB 驗證 mTORC1 相關分子的變化。DDIT4 過表達顯著抑制 mTOR、S6K 和 4EBP1 的磷酸化水平，提示 mTORC1 信號激活降低（圖 5F）。為進一步驗證 DDIT4 以 mTORC1 依賴方式調節 GPX4 蛋白表達，研究進行了救援實驗：具體而言，對 DDIT4 過表達細胞使用亮氨酸（Leu，mTORC1 激活劑）處理，而對 DDIT4 沉默細胞使用雷帕霉素（mTORC1 抑制劑）處理；隨后檢測兩組 GPX4 蛋白水平。如圖 5G 所示，亮氨酸處理有效恢復了被 DDIT4 過表達抑制的 GPX4 蛋白水平。相反，雷帕霉素處理顯著降低了 DDIT4 缺陷細胞中的 GPX4 蛋白水平（圖 5H）。上述數據提示 DDIT4 主要通過 mTORC1 信號通路調節 GPX4 蛋白水平。然而，GPX4 救援并不能逆轉 DDIT4 對 mTORC1 活性的抑制（數據未顯示），表明 DDIT4 抑制 mTORC1 信號獨立于其與 GPX4 的相互作用。

考慮到 GPX4 在胞質和線粒體中的雙重定位，研究進一步探索 DDIT4 是否影響 GPX4 的蛋白定位。研究檢測了經 PAOA 處理的 DDIT4 過表達肝細胞中的 GPX4 蛋白含量，并分離胞質和線粒體蛋白。出乎意料的是，與對照細胞相比，DDIT4 過表達細胞線粒體中的 GPX4 蛋白含量顯著降低（圖 5H）。為闡明 DDIT4 如何影響 GPX4 的線粒體轉運，研究首先通過 CO-IP 檢測 DDIT4 與線粒體導入機器關鍵組分 TOM20、TOM22 和 TOM70 的相互作用。有趣的是，DDIT4 特異性結合 TOM22，而不結合 TOM20 或 TOM70（圖 5J），提示 DDIT4 與 TOM22 存在直接相互作用。接下來，為確定 DDIT4 結合是否抑制 TOM22 介導的 GPX4 線粒體導入，研究在 DDIT4 缺陷原代肝細胞中使用 siRNA 敲低 Tom22。雖然 DDIT4 缺陷肝細胞中的線粒體 GPX4 水平升高，但進一步敲低 TOM22 后，線粒體 GPX4 顯著減少（圖 5K）。這些數據表明，TOM22 介導 GPX4 的線粒體轉運，而 DDIT4 與之結合會損害這一過程。鑒于線粒體 GPX4 在抑制鐵死亡中發揮關鍵作用[33]，研究結果提示 DDIT4 與 TOM22 相互作用可阻斷 GPX4 的線粒體導入，從而使肝細胞更易發生鐵死亡。

總體而言，研究提出 DDIT4 通過兩個并行且協調的機制驅動線粒體鐵死亡并促進 MASH 進展。一方面，它抑制 mTORC1 介導的 GPX4 從頭合成；另一方面，它通過同時與 GPX4 和 TOM22 相互作用，損害 GPX4 的線粒體轉運。這種雙重擾動會降低全細胞尤其是線粒體中的 GPX4 儲備，最終使肝細胞對鐵死亡更加敏感，并促進 MASH 進展（圖 5L）。

圖 5. DDIT4 通過抑制 GPX4 表達及其線粒體轉運促進鐵死亡。A. 篩選 DDIT4 相互作用蛋白的示意圖。原代肝細胞感染 Flag-Ddit4 后接受 PAOA 處理 24 h。細胞裂解物與 DDIT4 抗體或兔 IgG 對照孵育，隨后進行免疫沉淀和質譜（IP-MS）分析；展示 GO 分析鑒定出的氧化還原酶活性相關蛋白。B. 取 DDIT4 過表達小鼠原代肝細胞，經 PAOA 處理 6 h；用抗 DDIT4 抗體進行免疫沉淀（IP），并對全細胞裂解物中所示蛋白進行 western blot（WB）分析。C. 用抗 DDIT4 抗體進行 IP，并對胞質和線粒體裂解物中所示蛋白進行 WB 分析。D. 原代肝細胞感染 Flag-Ddit4 或 Flag-Vector 后，全細胞裂解物中 GPX4 和 DDIT4 蛋白水平的 WB 分析。E. 原代肝細胞轉染 Ddit4 siRNA（siDdit4）或對照后，全細胞裂解物中 GPX4 和 DDIT4 蛋白水平的 WB 分析。F. 原代肝細胞感染 Flag-Ddit4 或 Flag-Vector 后，mTORC1 信號相關蛋白的 WB 分析。G. 原代肝細胞感染 Flag-Ddit4 或 Flag-Vector 并用亮氨酸（Leu）處理后，GPX4 和 mTORC1 信號相關蛋白的 WB 分析。H. 原代肝細胞轉染 Ddit4 siRNA 或對照并用雷帕霉素處理后，GPX4 和 mTORC1 信號相關蛋白的 WB 分析。I. 原代肝細胞感染 Flag-Ddit4 或 Flag-Vector 并接受 PAOA 或 BSA 處理后，胞質和線粒體裂解物中 GPX4 蛋白水平的 WB 分析。J. 來自 DDIT4 過表達小鼠的原代肝細胞經 PAOA 處理 6 h；用抗 DDIT4 抗體進行 IP，并對全細胞裂解物中所示蛋白進行 WB 分析。K. Ddit4 敲低（siDdit4）或對照原代肝細胞轉染 Tom22 siRNA（siTom22）；通過 WB 檢測線粒體裂解物中的 GPX4 和 TOM22 蛋白水平。L. DDIT4 介導調控 GPX4 合成及其線粒體轉運的示意圖。數據表示為均值 ± SEM，**p < 0.01，***p < 0.001；兩組比較采用雙尾 Student t 檢驗。圖像經 BioRender.com 授權制作。

3.7 GPX4 過表達緩解 DDIT4 誘導的肝細胞脂質積累、炎癥和鐵死亡

為闡明 DDIT4 誘導的鐵死亡是否由 GPX4 抑制所造成，研究通過將 GPX4 表達質粒轉染至從 LKI 和 FLOX 小鼠分離的原代肝細胞中來恢復 GPX4 表達。通過檢測 GPX4 的 mRNA 和蛋白水平驗證了轉染效率（補充圖 S6A-B）。GPX4 救援能夠逆轉 DDIT4 誘導的鐵死亡，表現為細胞死亡率降低（圖 6A），細胞內脂質過氧化水平以及線粒體和全細胞 ROS 水平顯著下降（圖 6B）。此外，油紅 O 染色顯示 GPX4 過表達可改善 DDIT4 誘導的脂質積累（圖 6C），并降低細胞內 TG 含量（圖 6D）以及脂質合成和炎癥相關基因的 mRNA 表達（圖 6E）。上述數據表明，GPX4 介導了 DDIT4 在調控鐵死亡、脂質代謝和炎癥中的作用。

為驗證人肝組織中 GPX4 的變化，研究在收集的人 MASH 組織中通過 IHC 染色檢測 GPX4 蛋白表達。與 DDIT4 水平升高（圖 1B-C）相反，人 MASH 樣本中 GPX4 表達明顯降低（圖 6F-G）。此外，DDIT4 與 GPX4 呈強負相關（圖 6H）。綜上，這些數據為小鼠和人類 MASH 中存在 DDIT4-GPX4-鐵死亡軸提供了直接證據。

圖 6. GPX4 過表達緩解 DDIT4 誘導的肝細胞脂質積累、炎癥和鐵死亡。A. 來自 FLOX（對照）或 Ddit4 LKI 小鼠（Ddit4 OE）的原代肝細胞轉染 GPX4（Myc-Gpx4）或空載體（Myc-Vector），隨后用 BSA 或 PAOA 處理 24 h；采用 CCK8 法檢測細胞活力（n = 6/組）。B. 原代肝細胞中 Bodipy 581/591 C11、DCFH-DA 和 MitoSOX 染色的代表性熒光顯微圖像（上圖）；柱狀圖為熒光染色定量（下圖）（n = 4/組）。C. 轉染 GPX4 或空載體的對照或 Ddit4 OE 肝細胞油紅 O 染色的代表性顯微圖像。D. 肝細胞 TG 水平（n = 4/組）。E. 與脂質代謝和炎癥相關基因的相對 mRNA 表達水平（n = 3/組）。F. 非 MASH 和 MASH 個體肝切片中 GPX4 IHC 染色的代表性顯微圖像。G. 所示個體肝切片中 GPX4 IHC 染色的定量分析（n = 12/組）。H. DDIT4 表達與 GPX4 表達的相關性分析。數據表示為均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示無顯著性。兩組比較采用雙尾 Student t 檢驗，多組比較采用單因素 ANOVA 并進行 Tukey 事后檢驗。

3.8 肝細胞特異性 DDIT4 缺失緩解鐵死亡和 MASH 進展

為探索靶向 DDIT4 是否能夠抑制鐵死亡并緩解 MASH 進展，研究利用 CRISPR/Cas9 技術構建了 DDIT4 敲除 FLOX 小鼠（補充圖 S7A）。通過向 DDIT4 敲除 FLOX 小鼠尾靜脈注射腺相關病毒 AAV8-TBG-Cre，獲得肝細胞特異性 DDIT4 敲除小鼠（Ddit4 KO）；對照組（Control）注射 AAV8 空病毒（補充圖 S7B）。研究驗證了肝細胞中 DDIT4 水平顯著降低（補充圖 S7C）。6 周齡 DDIT4 KO 和對照小鼠接受 GAN 飲食喂養 16 周，兩組體重無顯著差異（補充圖 S7D）；而 KO 小鼠肝重和肝重/體重比均較低（圖 7D-E）。GTT 和 ITT 顯示，與對照組相比，KO 小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性顯著改善（圖 7A-B）。H&E 染色和油紅 O 染色顯示，KO 小鼠肝臟脂質積累減少（圖 7C）。F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色也顯示，KO 小鼠肝臟炎癥和纖維化得到緩解（圖 7C）。

KO 小鼠血清和肝臟 TG 含量均顯著低于對照組（圖 7F-G），而兩組 TC 含量無顯著差異（圖 7H-I）。KO 小鼠血清 ALT 和 AST 水平也顯著低于對照組（圖 7J-K）。

此外，DDIT4 敲除減輕了小鼠肝臟鐵死亡，表現為肝內鐵含量和 MDA 水平降低，以及 GSH/GSSG 升高（圖 7L-N）。總體而言，肝細胞特異性 DDIT4 消除可通過減少鐵死亡，并改善脂質積累、炎癥和纖維化，從而緩解 MASH 進展。

圖 7. 肝細胞特異性 DDIT4 缺失緩解鐵死亡和 MASH 進展。肝細胞特異性 DDIT4 缺失小鼠（KO）和對照小鼠接受 GAN 飲食喂養 16 周。A. GTT 及 GTT 的 AUC（n = 5-6 只/組）。B. ITT 及 ITT 的 AUC（n = 5-6 只/組）。C. 對照和 Ddit4 KO 小鼠肝臟 H&E 染色、油紅 O 染色、F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色的代表性顯微圖像；柱狀圖為相應染色陽性區域的統計分析（n = 4/組）。D-E. 肝重和肝重/體重比（n = 5-6 只/組）。F-G. 血清 TG 和 TC 水平（n = 5-6 只/組）。H-I. 肝臟 TG 和 TC 水平（n = 5 只/組）。J-K. 血清 AST 和 ALT 水平（n = 5-6 只/組）。L-N. 肝臟 Fe 含量、GSH/GSSG 和 MDA 水平（n = 5 只/組）。數據表示為均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns 表示無顯著性。兩組比較采用雙尾 Student t 檢驗。

3.9 黃酮醇類化合物槲皮萬壽菊素通過靶向 DDIT4 緩解 MASH

為鑒定可特異性靶向 DDIT4 的潛在化合物，研究通過分子對接篩選了商業可用化合物數據庫（MCE Compound Library）（補充圖 S8A）。根據對接評分，研究選擇排名前 6 的化合物進行進一步驗證，包括 Militarine（MLT）、二氫楊梅素（DHM）、槲皮萬壽菊素（QG）、橙皮苷甲基查爾酮（HMC）、曲二糖（KJ）和 Robinin（RB）（圖 8A）。研究評估了這些化合物是否能夠降低 PAOA 處理原代肝細胞中的脂質積累；油紅 O 染色和細胞內 TG 含量結果顯示，只有 DHM 和 QG 能夠顯著降低肝細胞脂質積累（圖 8B-C）。

QG（又稱 6-羥基槲皮素）是一種從萬壽菊（Tagetes erecta L.，菊科）中提取的黃酮醇化合物，具有抗氧化和抗病毒功能[34]。然而，其對 MASH 的作用仍不清楚。因此，研究選擇 QG 進行后續驗證。QG 的化學結構以及其與 DDIT4 的潛在結合模式如圖 8D 所示。QG 可能在 DDIT4 蛋白 LEU-109、ARG-113、TRP-186、LYS-188 和 GLN-206 殘基附近發生連接。此外，表面等離子體共振（SPR）實驗確認 QG 與 DDIT4 具有較強親和力，KD 值為 4.22e?06 M（圖 8E，補充表 1）。此外，研究發現 QG 處理可下調原代肝細胞中的 DDIT4，同時上調 GPX4 蛋白水平（補充圖 S8B）。

為研究 QG 給藥對體內 MASH 的影響，研究用 GAN 飲食喂養 C57B6/J 小鼠 16 周。隨后小鼠接受 QG 或溶劑對照灌胃 8 周。研究每周監測體重和血糖變化。結果顯示，QG 處理對體重無顯著影響（補充圖 S8C），但顯著改善了 MASH 小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性（圖 8F-G）。

QG 處理顯著降低肝重和肝重/體重比（圖 8I-J）。根據 H&E 染色、油紅 O 染色、F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色結果，QG 處理還緩解了 MASH 相關的肝臟脂質積累、纖維化和炎癥（圖 8H）。此外，QG 處理降低了血清 TG 和 TC 水平（圖 8K-L），并通過降低血清 ALT 和 AST 水平緩解肝損傷（圖 8M-N）。另外，QG 處理還減輕了肝臟鐵死亡，表現為肝臟鐵含量和 MDA 水平降低，以及肝臟 GSH/GSSG 比值升高（圖 8O-Q）。在基因水平上，QG 處理下調了與脂質代謝、炎癥和纖維化相關的基因（補充圖 S8D）。

為明確 QG 的靶向特異性，研究用 PAOA 和 QG 處理 DDIT4 缺陷肝細胞 24 h，隨后評估脂質積累。單獨敲除 DDIT4 或單獨 QG 處理均顯著減少脂質積累，表現為油紅 O 染色減少和細胞甘油三酯（TG）含量降低（補充圖 S8E-F）。然而值得注意的是，在 DDIT4 缺陷肝細胞中，QG 處理不能進一步減少脂質積累，說明 QG 通過特異性靶向 DDIT4 來緩解肝脂肪變。總體而言，這些結果表明，QG 是一種可通過靶向 DDIT4 改善 MASH 的新型化合物。

圖 8. 黃酮醇類化合物槲皮萬壽菊素（Quercetagetin）通過靶向 DDIT4 緩解 MASH。A. 分子對接篩選出的前 6 個靶向 DDIT4 的化合物列表。B-C. 來自 WT 小鼠的原代肝細胞用 BSA 或 PAOA 處理，并聯合 Militarine（MLT）、二氫楊梅素（DHM）、槲皮萬壽菊素（QG）、橙皮苷甲基查爾酮（HMC）、曲二糖（KJ）或 Robinin（RB）處理后的油紅 O 染色代表性顯微圖像及 TG 水平（n = 6/組）。D. QG 化學結構及其與 DDIT4 的潛在結合模式。E. 使用人重組 DDIT4 蛋白和逐漸升高濃度 QG 進行 SPR 分析。F. QG 或溶劑對照處理的 GAN 飲食誘導 MASH 小鼠 GTT 及 GTT 的 AUC（n = 8 只/組）。G. QG 或溶劑對照處理的 GAN 飲食誘導 MASH 小鼠 ITT 及 ITT 的 AUC（n = 4-5 只/組）。H. 對照或 QG 處理小鼠肝臟 H&E 染色、油紅 O 染色、F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色的代表性顯微圖像；柱狀圖為相應染色陽性區域的統計分析（n = 3/組）。I-J. 肝重和肝重/體重比（n = 5 只/組）。K-L. 血清 TG 和 TC 水平（n = 5 只/組）。M-N. 血清 AST 和 ALT 水平（n = 5 只/組）。O-Q. 肝臟 Fe 含量、GSH/GSSG 和 MDA 水平（n = 5-6 只/組）。數據表示為均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示無顯著性。兩組比較采用雙尾 Student t 檢驗。

【Citation】:Wang, H., Liu, W.-Y., Zhang, F., Chen, W., Hu, J., Cheng, R., Chen, Z., Wu, D., Xie, L., Tao, Y., Zheng, M.-H., & Hu, F. (2026). Hepatocyte DDIT4 aggravates MASH progression through GPX4-mediated ferroptosis.Metabolism, 180, 156622.

【貢獻】★★★★★

本研究揭示 DDIT4 是鐵死亡的正向調控因子，其上調會加重肝細胞脂質積累、炎癥和纖維化，從而促進鐵死亡和 MASH 進展。消除肝細胞 DDIT4 能夠緩解鐵死亡和 MASH 進展。在脂質應激條件下，DDIT4 使 GPX4 滯留于胞質，降低其線粒體蛋白水平，進而促進鐵死亡。因此，靶向 DDIT4 可能成為治療 MASH 的潛在策略。

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