引言

激素受體陽性/人表皮生長因子受體2陰性（HR+/HER2-）是乳腺癌（BC）最常見的分子亞型，但這些患者往往面臨耐藥問題，尤其是在晚期乳腺癌（mBC）中。一項發表于Scientific reports（IF=3.9）的研究基于細胞周期相關基因，構建并驗證了一個針對HR+/HER2- BC患者的預后標志評估模型（HBPS）。研究結果顯示，高HBPS評分患者的預后顯著更差，且與免疫抑制性腫瘤微環境、KRAS和IL2-STAT5信號通路下調以及特定基因（CDKN2C）缺陷導致的腫瘤侵襲性增強相關。這些發現為HR+/HER2- BC的個性化治療和耐藥機制提供了新的見解。據此，本文特將相關內容整理如下，以饗讀者。

研究背景

在乳腺癌中，超過2/3被歸類為HR+/HER2-亞型。內分泌治療是HR+/HER2- BC患者的重要治療方法。然而，約25%-50%的患者因原發性耐藥對內分泌治療反應不佳，即使原本對內分泌治療敏感，隨著時間的推移，獲得性耐藥不可避免。細胞周期蛋白依賴性激酶4和6抑制劑（CDK4/6i）通過阻滯腫瘤細胞周期，抑制癌細胞的分裂和增殖，其與內分泌治療的聯合方案也被推薦為HR+/HER2- mBC晚期乳腺癌的初始治療選擇。盡管CDK4/6i聯合治療為患者帶來療效獲益，但原發性和獲得性耐藥仍會限制其療效。

許多研究致力于闡明與CDK4/6i相關的耐藥機制。其中一種已識別的耐藥機制似乎涉及細胞周期相關基因軸的激活。盡管有這些見解，但導致細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑耐藥及其對預后影響的機制仍不清楚。此外，由于腫瘤異質性，如何精準識別能從CDK4/6i中獲益的HR+/HER2- BC患者目前仍是臨床挑戰。盡管細胞周期因子已被用于開發多種癌癥類型的預后模型，包括結腸癌、膀胱癌和肺腺癌，但其在HR+/HER2- BC中的預后預測價值仍不確定。

基于以上挑戰，本研究利用來自癌癥基因組圖譜（TCGA）和高通量基因表達數據庫（GEO）的綜合數據，開發并驗證了一個HBPS，并深入分析了HBPS評分與生物學特征之間的復雜關聯。

研究方法

數據來源方面，研究將來自TCGA數據集的421例HR+/HER2- BC患者作為訓練集。驗證集包括來自GSE96058數據集的2236例患者和METABRIC數據集的1369例患者。HR+/HER2- BC患者的核糖核酸（RNA）測序、全外顯子測序和臨床數據均從TCGA數據庫和UCSC Xena數據庫獲取。此外，來自已發表文獻的1874個細胞周期相關基因被納入分析。藥物敏感性數據——半數抑制濃度（IC50）及基因表達譜則來源于GDSC數據庫中51個BC細胞系的數據。

在模型的構建和分析中，研究首先利用R語言Limma包識別腫瘤和正常組織間的差異表達細胞周期相關基因。隨后，通過單變量Cox回歸分析篩選出與總生存期（OS）顯著相關的預后因子（P<0.01），并進一步進行多變量Cox分析以計算回歸系數，從而構建HBPS評分。根據HBPS評分中位數將患者分為高風險和低風險組，并使用R語言SurvMINER包分析兩組間的預后差異。受試者工作特征曲線（ROC）、曲線下面積（AUC）和一致性指數（C-index）則通過R語言timeROC包和Survival包計算，以評估模型的預測準確性。研究還基于多變量分析結果開發了預后列線圖，并使用校準曲線和C-index對其預測性能進行評估。

生物學機制分析方面，研究利用R語言GSVA包進行單樣本基因集富集分析（ssGSEA），計算50個Hallmark通路的標準化富集分數（NES）。通過Spearman相關分析識別與HBPS評分顯著相關的Hallmark通路（P≤0.05）。此外，使用R語言clusterProfiler包進行基因本體生物過程（GOBP）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。免疫細胞浸潤水平則通過CIBERSORT和ESTIMATE算法計算，并比較兩組間的免疫微環境差異。

體外實驗部分，研究獲取BC組織芯片（TMA）進行多重熒光免疫組化（mIHC）染色，分析CDKN2C和CD8的表達及其相關性。體外細胞功能實驗評估了CDKN2C過表達對HR+/HER2- BC細胞增殖、細胞周期、遷移和侵襲能力的影響。

研究結果

本研究首先在TCGA數據集中比較了乳腺腫瘤和正常組織，結果顯示，共鑒定出4400個差異表達基因（DEGs），其中有469個細胞周期相關基因，包括301個上調基因和168個下調基因。

HBPS的構建與驗證：

研究進一步分析了這469個差異表達基因與TCGA訓練集中患者生存期的關聯，鑒定出3個與HR+/HER2- BC的OS顯著相關的基因：CDKN2C、BRINP1和SYCP2。差異表達分析表明，BRINP1和CDKN2C在腫瘤組織中表達下調，而SYCP2在腫瘤組織中表達上調。CDKN2C表達（風險比=0.41，95%CI:0.21–0.80）和BRINP1表達（HR=0.40，95%CI:0.21–0.79）與更好的OS相關，而SYCP2表達（HR=2.62，95%CI:1.31–5.25）與更差的OS相關。

隨后，基于這三個基因的多變量Cox回歸分析構建了一個三基因的HBPS，其風險評分計算公式為：HBPS Score_os=(CDKN2C表達)x(-0.7356)+(BRINP1表達)x(-0.5094)+(SYCP2表達)x0.19421。根據HBPS評分中位數，TCGA訓練集患者被分為高評分、低評分組。

生存分析顯示，高HBPS評分患者的OS顯著劣于低評分組（HR=4.02，95%CI:1.93–8.35，P<0.001）。在調整年齡和PR狀態后，HBPS評分仍是獨立的預后因素（HR=3.57，95%CI:1.70–7.50，P<0.001）。時間依賴性的ROC分析顯示，HBPS評分在3年和5年的AUC分別為0.733（95%CI:0.619–0.847）和0.793（95%CI:0.704–0.883）。與TNM分期相比，HBPS評分在5年時的AUC存在顯著差異（P=0.001），但在3年時無顯著差異（P=0.301）。

在GSE96058和METABRIC兩個獨立的驗證數據集中，HBPS評分同樣顯示出高評分患者預后顯著更差的結果（P<0.001），進一步證實了其反映預后的能力。

預后列線圖的建立：

為便于臨床應用，研究將TCGA訓練集中的臨床特征和HBPS評分整合，構建了一個預后列線圖。該列線圖在OS預測中的C-index為0.81，表明其具有較好的預測性能。校準曲線進一步證實了該列線圖在預測1年、3年和5年OS方面與實際觀察結果具有良好的一致性。

HBPS風險組的臨床特征比較：

對TCGA數據集中HBPS評分與臨床特征的關聯分析顯示，HBPS評分在年齡、絕經狀態和同源重組修復缺陷（HRD）評分方面存在明顯差異。具體而言，年齡大于50歲、絕經后和HRD陰性患者的HBPS評分更高。

HBPS評分與生物學特征的關聯：

Spearman相關分析顯示，HBPS評分與更廣泛的生物學過程相關。高HBPS評分組與HALLMARK_KRAS_SIGNALING_DN和HALLMARK_IL2-STAT5信號通路呈負相關。GSEA分析進一步揭示，高HBPS評分患者的多種關鍵免疫相關通路顯著下調，包括趨化因子信號通路（NES=-1.671，P<0.001）、JAK-STAT信號通路（NES=-1.486，P=0.001）、細胞趨化（NES=-1.822，P<0.001）、白細胞介素-6產生（NES=-1.783，P<0.001）和T細胞活化（NES=-1.739，P<0.001）。

免疫微環境分析結果顯示，低HBPS評分與初始B細胞、CD8 T細胞、γ-δ T細胞、活化NK細胞和M1巨噬細胞浸潤水平顯著升高相關。相反，高HBPS評分與靜息CD4 T細胞、濾泡輔助T細胞、單核細胞、M0巨噬細胞和靜息肥大細胞浸潤水平顯著升高相關。此外，高HBPS評分組表現出更高的腫瘤純度和更強的免疫抑制狀態，例如CD40LG、PDCD1和SIRPA等檢查點基因的表達水平顯著降低。

探索性藥物敏感性分析顯示，HBPS高評分組對凋亡抑制蛋白（IAP）拮抗劑AZD5582的敏感性增加，而對其他9種藥物的敏感性降低。在轉移性尿路上皮癌隊列中，對程序性死亡受體配體-1（PD-L1）抑制劑治療無反應的患者通常具有更高的HBPS評分，這與高HBPS評分組觀察到的免疫抑制特征一致。

CDKN2C的表達與細胞功能驗證：

為進一步探究HBPS評分相關基因的臨床價值，研究分析了CDKN2C在腫瘤和癌旁組織中的表達。結果顯示，CDKN2C在HR+/HER2-腫瘤中的表達低于非HR+/HER2-腫瘤和癌旁組織（P≤0.05）。體外實驗表明，過表達CDKN2C顯著抑制MCF-7和T47D細胞增殖，并誘導G2/M期阻滯。此外，CDKN2C過表達顯著抑制了細胞遷移和侵襲。研究還發現，CDKN2C陽性腫瘤細胞與CD8+ T細胞呈正相關。綜上所述，CDKN2C缺陷與形成冷腫瘤免疫微環境和增強的HR+/HER2- BC細胞侵襲性相關。

討論與結論

本研究構建了一個基于細胞周期相關基因的HBPS，并在TCGA數據集以及兩個獨立的驗證數據集中得到了驗證。結果表明，高HBPS評分的患者往往預后更差。與低HBPS評分組相比，高評分組在HALLMARK_KRAS_SIGNALING_DN、HALLMARK_IL2_STAT5_SIGNALING以及其他免疫調節通路中表現出顯著下調。此外，高HBPS評分組還表現出更高的腫瘤純度和更強的免疫抑制性腫瘤微環境。多重免疫組織化學（mIHC）染色結果顯示，CDKN2C+腫瘤細胞與CD8+ T細胞呈正相關。體外實驗進一步揭示，CDKN2C過表達可導致細胞系增殖和侵襲性降低。

本研究觀察到高HBPS評分患者的HALLMARK_KRAS_SIGNALING_DN基因集下調，已知KRAS通路的激活通過MAPK和PI3K等下游信號通路促進細胞存活和增殖，這可能也是CDK4/6i耐藥的機制之一，并在免疫抑制性腫瘤微環境的形成中發揮重要作用。這些觀察結果支持了高HBPS評分患者預后較差的結論。

同時，研究還注意到低HBPS評分患者的免疫調節通路（如IL-2-STAT5和JAK-STAT通路）上調。既往研究表明，IL-2通過激活STAT5信號通路調節PD-1基因表達，并增強CD8+ T細胞對表達PD-1陽性細胞的敏感性，可能提高T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。

此外，研究發現低HBPS評分與CD8+免疫細胞浸潤水平升高和免疫檢查點表達增加呈正相關。體外實驗也證實，HBPS中的CDKN2C基因過表達與CD8+ T細胞呈正相關并降低腫瘤侵襲性，這些發現可能解釋了低評分組患者臨床預后改善的原因。值得注意的是，高評分組中有三個Hallmark通路顯著上調：HALLMARK_ESTROGEN_RESPONSE_EARLY、HALLMARK_PROTEIN_SECRETION和HALLMARK_ESTROGEN_RESPONSE_LATE。既往研究指出，HALLMARK_ESTROGEN_RESPONSE_LATE在對免疫治療有反應的黑色素瘤患者中顯著下調。這提示高HBPS評分組可能導致免疫治療的療效降低，并與轉移性尿路上皮癌隊列中觀察到的免疫治療反應差異一致。

構成HBPS的三個基因，CDKN2C、BRINP1和SYCP2，均參與細胞周期活動，并可能影響腫瘤微環境和侵襲性。研究發現CDKN2C缺陷與形成冷腫瘤免疫微環境和增強的HR+/HER2- BC細胞侵襲性相關。BRINP1基因編碼一種通過負向調節G1期到S期轉變來抑制細胞增殖的蛋白，并參與非經典細胞凋亡。SYCP2基因編碼突觸復合體的主要組分，可能結合支架附著區DNA，其過表達與BC預后不良相關，并參與DNA甲基化和免疫浸潤通路。本研究中SYCP2表達增加與風險評分呈正相關。在HR+/HER2- BC患者中，CDKN2C、BRINP1和SYCP2基因的突變率很低（約1.9%），其差異表達水平可能歸因于表觀遺傳異質性或特定信號通路的調節。

綜上所述，本研究構建了一個基于細胞周期相關基因的HR+/HER2- BC有效預后標志評估模型。兩組間廣泛的生物學差異揭示了導致預后差異的潛在因素。這些發現不僅有助于更好地理解HR+/HER2- BC，也為個體化用藥和解決耐藥問題提供了新的方向。

參考文獻：

1.Liu Y, et al. A prognostic signature for hormone receptor-positive, human epidermal growth factor receptor 2-negative breast cancer. Sci Rep. 2025 Jul 22;15(1):26617.

審批編號：CN-183334

有效期至：2027-04-27

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撰寫：Carp

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