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氣味制備
實驗所用四種氣味試劑(苯乙酮、正辛醛、蒎烯、檸檬烯)以礦物油為溶劑、臨實驗前按1%體積比新鮮配制;氣味由自研嗅覺儀配合四通閥完成氣路調控,常態下潔凈空氣持續通氣、氣味管路排空,試次期間閥門切換通入帶味氣流,試次結束后廢氣排空并恢復潔凈空氣供給。
實驗開始前,將苯乙酮、正辛醛、蒎烯與檸檬烯四種氣味試劑以1%比例溶于礦物油稀釋備用。氣味經由貫通小鼠鼻部的管路,隨恒定氣流送入。實驗采用自研嗅覺儀控制氣路,配備四通閥:單個試次中,閥組可切斷排空氣流、切換為帶氣味的供氣;試次結束后,閥門切換將氣味氣體導回排空管路,換回潔凈空氣。
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Fig1 四嗅素嗅覺厭惡條件化范式示意圖
整體實驗時序
(連續3天,固定順序:預測試→條件化訓練→正式測試)
實驗動物全程使用頭部固定+虛擬洞穴裝置(除第二天訓練在電擊箱)
Day1:預測試(學習前基線檢測)
1. 環境:小鼠固定于虛擬洞穴系統,無電擊、無獎懲。
2. 試次結構:總共10個block,每block隨機打亂4種氣味順序,單只動物合計40個試次。
3. 單試次參數:氣味持續呈現8 s。
4. 刺激分組平衡設計:個體間平衡CS+/CS?分配,例:苯乙酮在A鼠為CS+(后續配對電擊),在B鼠為CS?(無電擊),消除氣味本身先天偏好干擾。
5. 觀測指標:記錄顫抖、入洞行為;預測試階段CS+候選氣味與CS?候選氣味誘發行為無統計學差異,證明氣味本身不天然誘發恐懼避險。
Day2:厭惡條件化訓練(電擊配對建立條件恐懼)
1. 環境:更換Med Associates標準化電擊箱體,柵格地板用于足底電擊,配套強力真空抽氣系統。
2. 刺激規則:4種氣味每種重復呈現8次;
2種氣味=CS+:氣味結束同步施加0.7 mA足底電擊;
剩余2種氣味=CS?:氣味出現全程無電擊。
3. 試次間隔:ITI=3 min,真空泵快速抽走箱內殘留氣味,避免氣味殘留混淆條件關聯。
4. 控制邏輯:Arduino控制氣味發放,TTL脈沖信號觸發電擊控制器精準同步電擊。
Day3:正式行為測試(恐懼表達檢測)
1. 環境:回到Day1同款虛擬洞穴裝置。
2. 試次范式:試次排布、block數量、氣味時長(8 s)完全復刻預測試方案,僅此時CS+已通過訓練成為厭惡條件刺激、CS?為中性對照。
3. 觀測指標:量化CS+/CS?誘發的入洞幅度、入洞頻次、顫抖時長/頻率等行為差異。
關鍵控制要點
1. 氣味偏置控制:跨小鼠輪換CS+歸屬,避免氣味固有氣味偏好干擾實驗結果;
2. 殘留氣味排除:訓練日強負壓抽氣+3 min長間隔,消除殘留氣味的跨試次污染;
3. 數據同步:氣味觸發時間、洞穴運動軌跡、氣味濃度三者時間戳統一,便于后續行為刺激時序關聯分析。
總結
相較于傳統恐懼條件范式,本四嗅素模型可同步區分顫抖、入洞兩種層級化防御行為,通過氣味間CS+/CS?隨機平衡消除先天嗅覺偏好干擾;依托頭部固定與虛擬洞穴裝置精準量化行為指標,還可兼容鈣成像、呼吸監測等多模態同步記錄,且測試階段無電擊刺激,能在消退環境下客觀解析情緒神經編碼。
該范式可依托氣味誘發的恐懼泛化特點構建焦慮、PTSD動物模型,模擬創傷后恐懼泛化與過度警覺等病理表現以探究發病機制,同時通過CS+與CS?帶來的顫抖、入洞行為變化量化藥效,實現抗焦慮、抗PTSD候選藥物的篩選與藥效評估。
文獻引用:
O’Neill, PK., Posani, L., Meszaros, J. et al. The representational geometry of emotional states in basolateral amygdala. Nat Neurosci (2026). https://doi.org/10.1038/s41593-026-02315-y
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