上海
氣味制備
實驗所用四種氣味試劑（苯乙酮、正辛醛、蒎烯、檸檬烯）以礦物油為溶劑、臨實驗前按1%體積比新鮮配制；氣味由自研嗅覺儀配合四通閥完成氣路調控，常態下潔凈空氣持續通氣、氣味管路排空，試次期間閥門切換通入帶味氣流，試次結束后廢氣排空并恢復潔凈空氣供給。
實驗開始前，將苯乙酮、正辛醛、蒎烯與檸檬烯四種氣味試劑以1%比例溶于礦物油稀釋備用。氣味經由貫通小鼠鼻部的管路，隨恒定氣流送入。實驗采用自研嗅覺儀控制氣路，配備四通閥：單個試次中，閥組可切斷排空氣流、切換為帶氣味的供氣；試次結束后，閥門切換將氣味氣體導回排空管路，換回潔凈空氣。
Fig1 四嗅素嗅覺厭惡條件化范式示意圖
整體實驗時序
（連續3天，固定順序：預測試→條件化訓練→正式測試）
實驗動物全程使用頭部固定+虛擬洞穴裝置（除第二天訓練在電擊箱）
Day1：預測試（學習前基線檢測）
1. 環境：小鼠固定于虛擬洞穴系統，無電擊、無獎懲。
2. 試次結構：總共10個block，每block隨機打亂4種氣味順序，單只動物合計40個試次。
3. 單試次參數：氣味持續呈現8 s。
4. 刺激分組平衡設計：個體間平衡CS+/CS?分配，例：苯乙酮在A鼠為CS+（后續配對電擊），在B鼠為CS?（無電擊），消除氣味本身先天偏好干擾。
5. 觀測指標：記錄顫抖、入洞行為；預測試階段CS+候選氣味與CS?候選氣味誘發行為無統計學差異，證明氣味本身不天然誘發恐懼避險。
Day2：厭惡條件化訓練（電擊配對建立條件恐懼）
1. 環境：更換Med Associates標準化電擊箱體，柵格地板用于足底電擊，配套強力真空抽氣系統。
2. 刺激規則：4種氣味每種重復呈現8次；
2種氣味=CS+：氣味結束同步施加0.7 mA足底電擊；
剩余2種氣味=CS?：氣味出現全程無電擊。
3. 試次間隔：ITI=3 min，真空泵快速抽走箱內殘留氣味，避免氣味殘留混淆條件關聯。
4. 控制邏輯：Arduino控制氣味發放，TTL脈沖信號觸發電擊控制器精準同步電擊。
Day3：正式行為測試（恐懼表達檢測）
1. 環境：回到Day1同款虛擬洞穴裝置。
2. 試次范式：試次排布、block數量、氣味時長（8 s）完全復刻預測試方案，僅此時CS+已通過訓練成為厭惡條件刺激、CS?為中性對照。
3. 觀測指標：量化CS+/CS?誘發的入洞幅度、入洞頻次、顫抖時長/頻率等行為差異。
關鍵控制要點
1. 氣味偏置控制：跨小鼠輪換CS+歸屬，避免氣味固有氣味偏好干擾實驗結果；
2. 殘留氣味排除：訓練日強負壓抽氣+3 min長間隔，消除殘留氣味的跨試次污染；
3. 數據同步：氣味觸發時間、洞穴運動軌跡、氣味濃度三者時間戳統一，便于后續行為刺激時序關聯分析。
總結
相較于傳統恐懼條件范式，本四嗅素模型可同步區分顫抖、入洞兩種層級化防御行為，通過氣味間CS+/CS?隨機平衡消除先天嗅覺偏好干擾；依托頭部固定與虛擬洞穴裝置精準量化行為指標，還可兼容鈣成像、呼吸監測等多模態同步記錄，且測試階段無電擊刺激，能在消退環境下客觀解析情緒神經編碼。
該范式可依托氣味誘發的恐懼泛化特點構建焦慮、PTSD動物模型，模擬創傷后恐懼泛化與過度警覺等病理表現以探究發病機制，同時通過CS+與CS?帶來的顫抖、入洞行為變化量化藥效，實現抗焦慮、抗PTSD候選藥物的篩選與藥效評估。
文獻引用：
O’Neill, PK., Posani, L., Meszaros, J. et al. The representational geometry of emotional states in basolateral amygdala. Nat Neurosci (2026). https://doi.org/10.1038/s41593-026-02315-y
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