Western blot（WB）是生命科學蛋白定量檢測的核心主流手段，近幾年隨著期刊對圖像規范的要求不斷細化，如何做好 WB 圖像的記錄與處理，成為很多科研人員在投稿過程中需要認真對待的環節。

2022 年美國癌癥研究協會（AACR）對 1,367 篇論文的研究顯示，約 40.8% 的論文圖像問題都出在 WB 條帶上。這一數字提示我們，不少問題可能并非源于主觀造假，而是對規范不夠熟悉所致。

圖 1 被撤稿論文里，不同類型圖像問題的分布

比如一篇結直腸癌相關論文陷入長期圖像爭議：該文刊發于《Cell Death & Disease》，曾被指出文章圖 6G 多條 WB 條帶高度重合，圖像查重比對后可疑痕跡清晰可見；作者隨后說明兩組條帶來自不同轉印膜，相似僅為實驗條件所致，并公開全套原始未裁剪膜圖。

圖 2 β-TrCP 和 IGG 條帶與垂直拉伸后 P53R 顯示的條帶異常相似

另有一篇《Nature Aging》論文，其補充材料的 WB 圖中存在明顯拼接痕跡以及條帶復用、局部修圖等問題。

圖 3 受到爭議的 WB 條帶

從這些案例中可以看到，WB 圖像問題大致分為兩類：直觀可見的裁剪、復制泳道，以及隱蔽性更強的分區調色、無標注拼接條帶。

了解期刊的具體要求，是避免無意間留下疑似篡改痕跡的第一步。基于這一行業背景，本文系統整理 WB 圖像存檔、定量歸一化、論文作圖全套標準化實操規范，幫助正在投稿的科研人避坑。

WB 修圖：哪些操作期刊會重點關注

期刊和 AI 篩查系統通常會重點核查以下幾類操作，這些行為無論是否有意，都容易引發質疑：

六大查重高危行為

選擇性裁剪泳道：刪掉陰性、無差異條帶，只留存支撐實驗結論的條帶；

克隆復刻條帶：復制局部泳道、條帶片段，偽造獨立生物學重復樣本；

分區調色造假：局部單獨調亮度對比度，人為拉大 / 縮小組間蛋白表達差值；

修圖掩蓋瑕疵：用修復、克隆畫筆去除雜帶、膜片污漬，隱藏實驗原始缺陷；

無標注跨膜拼接：混用不同凝膠、不同曝光時長泳道，不加分割線、不圖注說明；

形變規避查重：旋轉、拉伸、翻轉條帶，改動原始成像形態躲避圖像比對。

相比之下，期刊通常允許的操作范圍相對明確：對整張膜統一微調亮度或對比度，并在圖注中注明調整參數，這屬于正常的圖像優化。需要注意的是，用于論文中展示的美化圖片和用于計算定量數值的原始圖像應當分開，數據統計必須基于未經任何修改的原始圖像。

原始文件的保存：投稿前提前整理好

期刊、合作者或同行有時會要求提供原始數據，提前整理好以下三類文件，會讓這個過程順暢很多：

第一類：無損原始文件，成像儀直出、零編輯 TIFF 原圖，不可壓縮、不可調色；

第二類：投稿定稿圖片，所有修改操作全程留痕，標注完整處理步驟；

第三類：成像元數據表格，記錄曝光、硬件全部參數，佐證實驗條件統一可控。

換一種 WB 定量方式，或可規避這類風險

最后，即便有了細致的記錄和透明的圖像處理，蛋白質印跡數據的可靠性最終仍取決于這些圖像如何被定量和解讀。因此，歸一化是圖像完整性的關鍵延伸，可確保所觀察到的差異反映的是生物學現象，而非上樣或分析中的變異。

實踐中，這種傳統上通過光密度分析實現，即將條帶強度歸一化到單一上樣對照，通常是 GAPDH 或肌動蛋白（actin）等管家蛋白。這種方法至今仍被廣泛使用，但存在公認的局限。單一對照歸一化假定上樣對照蛋白在各實驗條件下保持不變，且各泳道的總蛋白上樣量一致。這些假定在每個實驗體系中都需要加以驗證。

而總蛋白歸一化與總蛋白上樣量（Stain-Free 及相關方法）一種替代的歸一化方法是通過 Stain-Free 技術（例如 Bio-Rad Stain-Free 凝膠）或如 Ponceau S 這類可逆染色法進行總蛋白檢測。Stain-Free 技術利用蛋白質中色氨酸殘基在紫外激活下的固有熒光，無需額外染色即可檢測和定量每個泳道的總蛋白，優勢包括：

歸一化到總蛋白，而非單一對照

檢測單一管家蛋白可能遺漏的潛在上樣不一致

減少膜剝離和重新探測的步驟

近期證據支持總蛋白歸一化具有更高的可重復性。一項比較各歸一化方法的分析[1]發現，與肌動蛋白或 β-微管蛋白歸一化相比，Stain-Free 歸一化降低了變異性，并將達到統計學顯著性所需的樣本量減少了 50% 以上。

在發表方面，《生物化學雜志》（Journal of Biological Chemistry）推薦歸一化到總蛋白，但強調只有在研究者已證明管家蛋白的表達不受實驗處理影響時，才可使用管家蛋白。最嚴謹的做法是在補充數據中同時報告總蛋白歸一化值和管家蛋白歸一化值，使讀者能夠評估結論的穩健性。

圖 4 Stain-Free 技術在寬廣的蛋白質濃度范圍內提供總蛋白與信號之間的 1:1 對應關系。A，Stain-Free 總蛋白信號；B，β-肌動蛋白信號；C，β-微管蛋白信號；D，GAPDH 信號；E，在一系列蛋白質濃度范圍內總蛋白歸一化與管家蛋白歸一化線性度的比較。

專業成像設備加持，筑牢數據合規防線

除了優選總蛋白歸一化方法，專業成像設備也能為 WB 實驗的數據合規與精準定量全面保駕護航。

Bio-Rad 的 ChemiDoc MP 成像系統兼具高性能化學發光與多色熒光成像能力，綜合表現優于同類設備，可無縫搭配 Stain-Free 免染流程，在電泳、轉印全環節完成質控，完美適配總蛋白歸一化分析需求。

儀器搭載簡易易上手的 Image Lab Touch 軟件，上手門檻低，幾分鐘即可完成圖像采集。它支持單膜同步檢測三種蛋白，可精準區分并定量磷酸化等微小翻譯后修飾，化學發光靈敏度更是媲美甚至超越傳統壓片法。

圖 5 ChemiDoc MP 成像系統在 WB 實驗中的作用

更可靠的是，設備采用專屬 .scn 不可篡改原始數據格式，搭配賬號權限分級、禁止數據刪除與拷貝等多重安全管控，完整留存成像參數、時間戳等元數據，從硬件與軟件雙重維度筑牢原始數據防線，滿足頂刊對 WB 圖像溯源、數據完整性的要求。

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結論

圖像合規、完整溯源、科學定量，是當下 WB 實驗順利發表的三大核心要點。

熟悉修圖邊界、做好文件存檔，并根據實驗體系選擇穩定性更佳的 Stain-Free 總蛋白歸一化方法，可以讓實驗數據更扎實、審稿更順暢。

而專業設備是落實各項規范的重要支撐，ChemiDoc MP 成像系統不僅擁有高靈敏度成像、多色熒光同步檢測等性能優勢，還憑借專屬數據格式、權限管控等功能杜絕原始數據篡改問題，全程匹配頂刊溯源要求，結合 Stain-Free 流程實現全環節質控，全方位為 WB 實驗的數據合規與科研誠信保駕護航。

注：

1. 相關產品僅限科研使用，不作為臨床診斷。

2. Bio-Rad 為 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定區域的商標。本文所使用的所有商標均歸其各自所有者所有。? 2026 Bio-Rad Laboratories, Inc.

3. 本活動的最終解釋權歸伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。

內容策劃：沈佳鈺

內容審核：周育紅

題圖來源：圖蟲創意

參考文獻：

[1] Maloy A et al. (2023). Stain-Free total-protein normalization enhances the reproducibility of Western blot data. Anal Biochem 654, 114840.