2026年6月30日，北華大學藥學院藥理學系王夢陽副教授團隊，聯合 QU Health 基礎醫學系Ali H. Eid、浙江現代中藥與天然藥物研究院以及復旦大學藥學院等，在British Journal of Pharmacology（中科院2區，IF=7.5）在線發表題為 “Fangchinoline alleviates hypertensive heart failure via PGC-1α/STAT6/PPARγ activation of mitophagy against ferroptosis” 的研究論文。PDF顯示該文于2026年2月3日投稿，2026年5月10日修回，2026年5月31日接收。

該研究聚焦高血壓相關心力衰竭中“線粒體質量控制—鐵死亡”這一關鍵病理環節。研究者以血管緊張素 II（Ang II）誘導的小鼠高血壓性心力衰竭模型和新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）損傷模型為基礎，發現粉防己堿（Fangchinoline，FAN）能夠改善 Ang II 誘導的心肌肥大、心功能障礙和纖維化。更重要的是，這種保護作用并不依賴降血壓效應，而是與激活 PGC-1α 介導的線粒體自噬、調控 STAT6/PPARγ 通路并抑制心肌細胞鐵死亡密切相關。

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【摘 要】

粉防己堿（Fangchinoline，FAN）是來源于粉防己（Stephania tetrandra）的一種具有生物活性的雙芐基異喹啉類生物堿。已有研究提示其可能對血管緊張素 II（angiotensin II，Ang II）誘導的高血壓性心力衰竭（heart failure，HF）具有保護潛力，但其是否涉及線粒體自噬和鐵死亡調控仍不清楚。本研究旨在評估 FAN 對 Ang II 誘導的心臟重構和心力衰竭的作用。

研究者通過連續4周輸注 Ang II，在 C57BL/6 小鼠中建立高血壓性心力衰竭模型，并在最后2周給予 FAN 干預。研究采用超聲心動圖評估心功能，通過組織學染色評價病理性心臟重構，并對心臟組織進行 RNA 測序，以探索 FAN 抗心力衰竭的作用機制。隨后，研究利用分子對接、藥物親和反應靶點穩定性實驗（DARTS）、細胞熱遷移實驗（CETSA）和表面等離子共振（SPR）驗證 FAN 的潛在結合蛋白。在體外實驗中，研究者采用新生大鼠心室肌細胞（NRVMs），考察 FAN 對細胞肥大、線粒體自噬和鐵死亡的影響。

體內實驗顯示，FAN 處理顯著改善心肌肥大、心功能障礙和心肌纖維化，且這些保護作用并不依賴降血壓效應。機制上，FAN 可激活 PGC-1α，增強線粒體自噬，并抑制 STAT6-PPARγ 信號，從而抑制鐵死亡并恢復氧化還原穩態。體外實驗進一步表明，FAN 可減輕 Ang II 誘導的 NRVMs 肥大、活性氧（ROS）生成和線粒體膜電位去極化，并證實其可調節線粒體自噬和鐵死亡相關標志物。

研究結果表明，FAN 可通過激活 PGC-1α 介導的線粒體自噬并調控 STAT6-PPARγ 通路，最終抑制心肌細胞鐵死亡，從而緩解 Ang II 誘導的心力衰竭。這些發現為心力衰竭治療提供了新的研究視角。

關鍵詞：粉防己堿；心力衰竭；線粒體自噬；PGC-1α；PPARγ；STAT6

01

研究背景及科學問題

心力衰竭（heart failure，HF）是一種臨床異質性很強的綜合征，其病理生理機制復雜且受多因素影響，不同患者的病程進展和結局差異明顯。心力衰竭給全球醫療系統帶來沉重負擔，影響人數巨大。隨著人口老齡化和總人口增長，心力衰竭的發病率和患病率持續上升，尤其在65歲及以上成年人中，心力衰竭是住院的重要原因之一。流行病學研究普遍認為，在發達國家，高血壓是心力衰竭最主要的病因驅動因素之一，常進一步發展為高血壓性心臟病，表現為心肌結構和功能的適應不良性重構。因此，闡明心力衰竭的分子基礎，并據此優化治療策略，仍是當代心血管研究的核心問題。

在這一病理框架下，腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）被認為是疾病進展的重要介質。RAS 過度激活可促進心室肥大，維持炎癥信號，并加速纖維化重構，最終推動心功能障礙持續進展。血管緊張素 II（Ang II）是 RAS 的主要效應肽，可直接作用于血管平滑肌細胞產生強烈收縮效應，同時通過激活血管緊張素 II 1型受體（AT1 receptor）誘導心肌細胞病理性肥大。與此同時，Ang II 還可通過激活 NADPH 氧化酶促進活性氧（ROS）過量生成，引發氧化應激級聯反應，破壞線粒體完整性和功能。線粒體損傷可表現為膜電位喪失、ATP 合成減少以及線粒體動力學異常，這些改變均直接參與心力衰竭的發生發展。盡管血管緊張素受體阻滯劑（ARBs）和血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEIs）等 RAS 抑制劑仍是臨床治療的重要基礎，但部分患者仍存在治療反應不佳，且長期使用可能受到咳嗽、血管性水腫等不良反應限制。因此，尋找能夠減輕 Ang II 誘導心臟毒性的替代或輔助治療策略具有重要意義。

在這一治療背景下，植物、草藥及其活性成分因可能調控心血管病理過程而受到越來越多關注。粉防己（Stephania tetrandra）是一種傳統藥用植物，含有粉防己堿（FAN）和漢防己甲素等雙芐基異喹啉類生物堿，具有較突出的藥理活性。這些化合物具有抗炎、抗氧化和心臟保護特性，因此成為轉化研究中值得關注的候選分子。既往研究顯示，漢防己甲素可通過下調瞬時受體電位香草酸亞型2（TRPV2）表達，減輕心肌缺血/再灌注損傷，并調節心肌細胞凋亡、鈣穩態和線粒體功能。另有研究提示，漢防己甲素可通過抑制 MAPK/NF-κB 通路改善心室重構并抑制炎癥信號。這些發現提示，來源于粉防己的生物堿可能具有多效性的心臟保護作用，也為進一步評價 FAN 在心力衰竭中的作用提供了理論依據。

進一步來看，FAN 已逐漸被證實具有廣泛的藥理活性和機制多樣性。其生物學作用包括抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化等。值得注意的是，FAN 可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/ULK1 通路誘導自噬，從而抑制結直腸癌生長。在心肌細胞穩態維持中，自噬，尤其是線粒體自噬，發揮著關鍵作用，可選擇性清除受損線粒體。線粒體自噬失調會導致功能異常線粒體積累，促進 ROS 生成和脂質過氧化，最終誘發鐵死亡。然而，FAN 是否能夠通過調控“線粒體—鐵死亡”軸來保護高血壓性心力衰竭，目前仍未明確。

線粒體動力學調控真核細胞代謝，其中過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 共激活因子 1α（PGC-1α）是協調線粒體生物發生和氧化能力的重要因子。PGC-1α 通過調控維持線粒體功能所需的轉錄程序，直接影響心肌細胞在病理應激下的耐受能力。既往研究顯示，神經氨酸酶1可通過 SIRT1/PGC-1α 軸調控心肌梗死后模型中的線粒體能量穩態和氧化應激，進一步說明該通路在心臟損傷中的功能重要性。另一方面，STAT6/PPARγ 信號級聯也被認為參與心臟重構，相關證據提示巨噬細胞 p47phox 可通過 IL-4/STAT6/PPARγ 信號參與壓力負荷誘導的心室重構。

然而，PGC-1α、STAT6 和 PPARγ 是否在心力衰竭中構成一個整合性調控軸，目前仍不清楚。為回答這一問題，本研究同時采用體內心力衰竭模型和體外心肌細胞損傷模型，系統評價 FAN 對心功能、心肌纖維化以及鐵死亡相關關鍵通路的影響。研究結果顯示，FAN 可抑制鐵死亡，并首次將其心臟保護作用與 PGC-1α/STAT6/PPARγ 軸的調控聯系起來。該整合性信號網絡可能通過直接或間接相互作用，在 Ang II 誘導的應激條件下協調線粒體自噬和鐵死亡反應。闡明這一相互關系不僅有助于深化對機制的理解，也為高血壓性心力衰竭，尤其是對標準治療反應不佳的患者，提供了多靶點治療策略的研究基礎。

02

重要發現及亮點

FAN 在體外篩選中顯示出減輕心肌細胞肥大和炎癥的潛力

為尋找 Ang II 誘導心力衰竭的潛在治療候選物，研究者首先對包含70種天然產物的化合物庫進行了初步篩選。篩選標準包括兩方面：一是降低心肌肥大標志物 ANP 表達的能力，二是保持較低細胞毒性。在這些候選化合物中，FAN 既能明顯抑制 ANP，又幾乎不表現出細胞毒性，因此被篩選為具有潛力的候選分子。進一步檢測顯示，FAN 抑制 ANP 表達的 EC50 為 5.208 μM，維持細胞活力的 IC50 為 28.47 μM。

隨后，研究者采用新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）構建體外模型，進一步驗證 FAN 對心肌細胞的直接保護作用。MTT 實驗顯示，FAN 濃度在10 μM以內時無明顯細胞毒性，細胞活力保持在90%以上，因此后續體外實驗選用5 μM和10 μM作為干預濃度。經 FAN 預處理1小時后，再用 Ang II（1 μM）刺激細胞8小時或24小時。Western blot 結果顯示，FAN 可劑量依賴性抑制 Ang II 誘導的 MYH7、ANP 和 BNP 蛋白上調。RT-qPCR 進一步顯示，FAN 同樣能夠降低這些心肌肥大相關基因的 mRNA 水平。此外，FAN 還能逆轉 Ang II 誘導的 Il1b、Il6 和 Tnf mRNA 上調。羅丹明-鬼筆環肽染色也證實，FAN 明顯減輕 Ang II 誘導的細胞肥大。上述結果表明，FAN 可通過抑制心肌細胞肥大和炎癥，對 Ang II 誘導的心肌細胞損傷發揮直接保護作用。

圖1：粉防己堿（Fangchinoline，FAN）通過抑制新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）的肥大和炎癥來保護心肌細胞。（a）基于天然產物庫并使用血管緊張素 II（Ang II）處理的 NRVMs 進行篩選的策略示意圖。候選化合物通過 ANP 檢測和細胞活力實驗進行鑒定。（b）熱圖顯示化合物庫對 ANP 的抑制率。細胞先用 Ang II（1 μM）處理24小時，隨后用每種化合物（10 μM）處理24小時。（c）相對細胞存活率熱圖。細胞先用 Ang II（1 μM）處理24小時，隨后用每種化合物（10 μM）處理24小時。（d）FAN 的化學結構。（e）MTT 實驗顯示 FAN 對 NRVMs 細胞的細胞毒性（n = 6 次獨立實驗）。（f）NRVMs 細胞中 MYH7、ANP 和 BNP 的代表性 Western blot 分析結果。GAPDH 作為上樣內參。（g）使用 ImageJ 對 F 圖中蛋白條帶強度進行定量分析。（h–j）RT-qPCR 顯示 NRVMs 中 Myh7、Anp 和 Bnp 的 mRNA 水平。（k–m）RT-qPCR 顯示 NRVMs 中 Il1b、Il6 和 Tnf 的 mRNA 水平。（n）TRITC-鬼筆環肽染色（紅色）顯示 FAN 對 Ang II 誘導的 NRVMs 肥大反應的影響。切片用 DAPI 進行復染（藍色）。所有定量數據均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，與 CON 組相比； < 0.05，與 Ang II 組相比。

FAN 改善 Ang II 誘導的小鼠心功能障礙和心臟重構

為評價 FAN 在體內對 Ang II 誘導心臟損傷的保護作用，研究者通過微量滲透泵連續4周輸注 Ang II（1000 ng kg?1 min?1）建立小鼠模型。FAN 在 Ang II 輸注2周后開始給藥，劑量為20 mg kg?1和40 mg kg?1；纈沙坦（valsartan，Val，4 mg kg?1）作為陽性對照。

模型觀察顯示，Ang II 輸注顯著升高小鼠收縮壓，并提高血清 Ang II 水平。然而，與未治療模型組相比，FAN 對血清 Ang II 水平無顯著影響，也未降低 Ang II 誘導的收縮壓升高。這提示 FAN 的心臟保護作用并不依賴降壓效應。盡管沒有表現出降壓活性，FAN 后續仍被證實可發揮明確心臟保護作用。

超聲心動圖分析顯示，Ang II 誘導小鼠出現心力衰竭和心肌肥大，而 FAN 可劑量依賴性改善心功能，表現為射血分數（EF）和短軸縮短率（FS）改善。FAN 還可顯著減輕 Ang II 誘導的病理性心臟重構，具體表現為心臟重量/體重比下降以及等容舒張時間（IVRT）縮短。進一步分析顯示，FAN 不影響心率，但可降低舒張末期左心室內徑（LVIDd）、舒張末期室間隔厚度（IVSD）、舒張末期后壁厚度（PWD）、心臟重量/脛骨長度比、Tei 指數，并增加 E 波速度，整體提示其可改善心臟重構。血清生化檢測顯示，FAN 可降低 Ang II 誘導的 CK-MB 升高。代表性超聲心動圖和多普勒血流圖也直觀顯示了上述心臟結構和血流動力學改善。總體來看，FAN 能有效改善 Ang II 誘導的心功能障礙。

圖2：粉防己堿（FAN）減輕血管緊張素 II（Ang II）誘導的小鼠心功能障礙和心臟重構。（a）動物實驗流程。（b）每周測量收縮壓。（c）通過 ELISA 測定小鼠血清 Ang II 水平。（d，e）使用超聲掃描成像系統測定小鼠射血分數（EF）和短軸縮短率（FS）。（f）心臟重量/體重（HW/BW）的定量分析。（g）等容舒張時間（IVRT）的測量。（h）使用 ELISA 試劑盒測定小鼠血清 CK-MB 水平。（i）通過無創超聲心動圖測定小鼠心功能。（j）激光散斑對比成像（LSCI）監測心臟灌注。所有定量數據均以 mean ± SEM 表示；n = 6；ns = 無顯著性差異；*P < 0.05，與 CON 組相比； < 0.05，與 Ang II 組相比。

FAN 緩解 Ang II 誘導的心肌肥大和纖維化

接下來，研究者通過大體心臟形態觀察和麥胚凝集素（WGA）染色評估心肌肥大。結果顯示，FAN 明顯改善 Ang II 誘導的心肌肥大。組織病理學分析進一步證實，Ang II 誘導的心力衰竭模型具有心肌肥大、炎癥和纖維化等關鍵病理特征。H&E 染色顯示，FAN 可顯著減輕 Ang II 誘導的心臟組織結構改變和心肌細胞增大。

病理性心肌肥大常與心肌間質纖維化并存，可表現為間質微瘢痕形成以及血管周圍膠原纖維沉積。Masson 三色染色和天狼星紅染色結果顯示，FAN 能有效抑制膠原沉積和細胞外基質重構。因此，FAN 可通過抑制心肌細胞肥大和纖維化，減輕 Ang II 誘導的病理性心臟重構。

圖3：粉防己堿（FAN）減輕血管緊張素 II（Ang II）誘導的心肌肥大和纖維化。（a）白色背景下新鮮心臟的代表性圖片（比例尺 = 5 mm）。（b）心臟組織麥胚凝集素（WGA）染色代表性圖像（比例尺 = 50 μm）。（c）心臟組織 H&E 染色代表性圖像（比例尺 = 50 μm）。（d）心臟組織 Masson 染色代表性圖像（比例尺 = 50 μm）。（e）Masson 三色染色顯示的間質纖維化區域百分比定量。（f）Masson 三色染色顯示的血管周圍纖維化區域百分比定量。（g）心臟組織天狼星紅染色代表性圖像（比例尺 = 50 μm）。（h）天狼星紅染色顯示的間質纖維化區域百分比定量。（i）天狼星紅染色顯示的血管周圍纖維化區域百分比定量。所有定量數據均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，與 CON 組相比； < 0.05，與 Ang II 組相比；ns = 與 CON 組相比無顯著性差異。

FAN 下調心肌肥大相關標志物并抑制炎癥因子表達

心力衰竭過程中，利鈉肽系統會發生代償性激活，并發揮一定心臟保護作用。Western blot 和 RT-qPCR 分析顯示，Ang II 可通過上調 MYH7、ANP 和 BNP 等肥大相關標志物誘導心肌肥大，而 FAN 能劑量依賴性降低這些標志物的表達。ANP 免疫熒光染色也直接證實了心肌細胞肥大狀態的變化。與此同時，mRNA 水平的同步下降進一步說明 FAN 對病理性心肌肥大具有保護作用。

慢性炎癥可導致心臟結構逐漸受損，并最終促進心臟纖維化。對心臟炎癥標志物的檢測顯示，Ang II 顯著上調 Il1b、Il6 和 Tnf 的 mRNA 水平，而 FAN 處理可有效抑制這一反應。因此，FAN 可通過直接下調肥大相關基因并抑制促炎因子，緩解病理性心臟重構。

圖4：粉防己堿（FAN）改善血管緊張素 II（Ang II）誘導的小鼠心肌肥大和炎癥。（a）心臟組織中 MYH7、ANP 和 BNP 的代表性 Western blot 分析結果。GAPDH 作為上樣內參。（b）使用 ImageJ 對 A 圖中蛋白條帶強度進行定量分析。（c）小鼠心臟組織中 ANP（綠色）免疫熒光代表性圖像，細胞核用 DAPI（藍色）復染。（d–f）通過 RT-qPCR 檢測心臟組織中 Myh7、Anp 和 Bnp 的 mRNA 水平。（g–i）通過 RT-qPCR 檢測心臟組織中 Il1b、Il6 和 Tnf 的 mRNA 水平。所有定量數據均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，與 CON 組相比； < 0.05，與 Ang II 組相比。

FAN 通過激活自噬通路緩解心力衰竭

為進一步探索 FAN 抵抗 Ang II 誘導心臟損傷的機制，研究者對心臟組織進行了 RNA 測序。比較分析顯示，CON 組與 Ang II 組之間共有352個差異表達基因，其中133個上調、219個下調；Ang II 組與 Ang II + FAN 組之間共有109個差異表達基因，其中52個上調、57個下調。KEGG 通路富集分析在兩組比較中均提示自噬是關鍵樞紐通路，說明其可能在 FAN 介導的心臟保護中發揮重要作用。樣本間相關性分析顯示，不同實驗組之間分離清晰，組內一致性較高。

線粒體自噬是一種專門靶向受損線粒體的自噬反應，可清除潛在具有細胞毒性的線粒體。由于線粒體在心血管系統能量代謝中處于核心位置，線粒體自噬對于維持心血管穩態和應對疾病狀態尤為重要。為證明線粒體自噬激活是 FAN 心臟保護作用的機制基礎，研究者檢測了線粒體自噬通路中的關鍵調控因子。Western blot 結果顯示，FAN 處理可上調 PGC-1α 及其上游調控因子 AMPK 和 SIRT1 的表達。PCR 分析也證實，FAN 顯著上調 PGC-1α 的 mRNA 表達。

此外，RNA 測序還用于預測潛在相關轉錄因子。結果顯示，FAN 可調控25個基因。對這些基因進行轉錄因子擾動和表達分析后，STAT6 被提示可能參與其中，并位列預測轉錄因子前3位。進一步驗證 STAT6 激活狀態顯示，Ang II 輸注顯著增加小鼠心臟組織中 STAT6 Tyr641 位點的磷酸化水平，而 FAN 處理可有效抑制這一激活。核質分離實驗進一步顯示，Ang II 可促進 STAT6 在細胞核內積累，而 FAN 可逆轉這一趨勢。總體而言，轉錄組學分析和分子驗證共同表明，FAN 一方面通過激活自噬通路，另一方面通過抑制轉錄因子 STAT6 的異常激活，從而緩解 Ang II 誘導的心臟損傷。

圖5：粉防己堿（FAN）通過激活自噬通路緩解心力衰竭（HF）。（a）對照組與血管緊張素 II（Ang II）處理組之間差異表達基因的柱狀圖。（b）Ang II 處理組與 FAN 預處理組之間差異表達基因的柱狀圖。（c，d）Ang II 處理組與對照組之間差異表達基因的 KEGG 通路富集分析。（c）氣泡圖，（d）柱狀圖。（e，f）Ang II 處理組與 FAN 預處理組之間差異表達基因的 KEGG 通路富集分析。（e）氣泡圖，（f）柱狀圖。（g）樣本間相關性分析。（h）心臟組織中 AMPK、p-AMPK、SIRT1 和 PGC-1α 的代表性 Western blot 分析結果。GAPDH 作為上樣內參。（i–k）使用 ImageJ 軟件對 H 圖中相應蛋白條帶強度進行定量分析。（l）Ang II 處理組相對于對照組、Ang II 處理組相對于 FAN 預處理 + Ang II 處理組的上調基因維恩圖。（m）轉錄因子擾動分析的排名列表。（n）通過免疫印跡檢測全心臟裂解液中 p-STAT6（Tyr641）水平。（o）使用 ImageJ 對 N 圖中蛋白條帶強度進行定量分析。（p）通過免疫印跡分析心臟裂解液核組分和胞質組分中的 STAT6 水平。（q，r）使用 ImageJ 對 P 圖中蛋白條帶強度進行定量分析。所有定量數據均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，與 CON 組相比； < 0.05，與 Ang II 組相比。

FAN 恢復自噬通量并抑制鐵死亡，從而緩解心力衰竭

為闡明 FAN 改善 Ang II 誘導心力衰竭的機制，研究者首先檢測了與線粒體穩態密切相關的 P53 通路。Western blot 顯示，Ang II 顯著上調 P21 和 P53 表達，而 FAN 處理能夠有效逆轉這些不利的分子變化。

Ang II 刺激還抑制了 ULK1 的磷酸化及其下游蛋白表達，并伴隨 P62 在小鼠心臟組織中積累，提示 Ang II 抑制自噬降解通路。不同濃度 FAN 預處理可呈濃度依賴性逆轉這種自噬抑制。與正常組相比，模型組 LC3-II/LC3-I 比值顯著降低；而 FAN 處理后該比值明顯上調。P62 免疫熒光染色進一步證實，模型組心臟組織中 P62 明顯積累，而 FAN 處理可顯著降低 P62 積累。這些結果提示，FAN 可有效改善 Ang II 誘導心力衰竭中的自噬受損。

進一步研究顯示，Ang II 處理改變了鐵死亡相關蛋白的表達。具體而言，心臟組織中 GPX4、CCBR1 和 SLC40A1 表達受到抑制，而 ACSL4 明顯上調。生化分析顯示，模型組心肌組織中丙二醛（MDA）和 Fe2+ 濃度顯著升高，谷胱甘肽（GSH）耗竭；FAN 處理則可顯著減輕這些變化。上述結果表明，FAN 可通過抑制鐵死亡通路緩解 Ang II 誘導的心力衰竭。

圖6：粉防己堿（FAN）通過恢復自噬通量并抑制鐵死亡緩解心力衰竭（HF）。（a）心臟組織中 P53、P21 的代表性 Western blot 分析結果。GAPDH 作為上樣內參。（b，c）使用 ImageJ 軟件對 A 圖中相應蛋白條帶強度進行定量分析。（d）心臟組織中 ULK1、p-ULK1、P62、mTOR、p-mTOR 和 LC3 的代表性 Western blot 分析結果。GAPDH 作為上樣內參。（e–h）使用 ImageJ 軟件對 D 圖中相應蛋白條帶強度進行定量分析。（i）小鼠心臟組織中 P62（綠色）免疫熒光代表性圖像，細胞核用 DAPI（藍色）復染。（j）心臟組織中 GPX4、CCBR1、SLC40A1 和 ACSL4 的代表性 Western blot 分析結果。GAPDH 作為上樣內參。（k–n）使用 ImageJ 軟件對 J 圖中相應蛋白條帶強度進行定量分析。（o）相關標志物丙二醛（MDA）的氧化應激水平。（p）相關標志物 GSH 的氧化應激水平。（q）使用 ELISA 試劑盒測定小鼠血清 Fe2+ 水平。所有定量數據均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，與 CON 組相比； < 0.05，與 Ang II 組相比。

FAN 在 Ang II 誘導的 NRVMs 中通過激活 PGC-1α 通路改善線粒體功能障礙和自噬受損

為驗證 FAN 是否能夠減輕 Ang II 誘導的氧化應激，研究者檢測了 NRVMs 中 ROS 的生成。代表性圖像顯示，Ang II 誘導后綠色熒光增強，提示細胞內 ROS 生成顯著升高；而 FAN 處理可明顯減輕這一氧化爆發。

Western blot 分析顯示，Ang II 刺激顯著上調 P21 和 P53，同時抑制 AMPK 磷酸化以及 SIRT1 和 PGC-1α 的表達；FAN 預處理可有效逆轉這些變化。SIRT1 免疫熒光染色也驗證了這一作用。Ang II 處理 NRVMs 后，p-ULK1 及其下游蛋白表達受到抑制，P62 和 p-mTOR 水平升高，提示自噬降解通路受抑。與對照組相比，模型組 LC3-II/LC3-I 比值顯著降低，而 FAN 處理后該比值明顯升高。

為了判斷 FAN 是否以 PGC-1α 依賴方式發揮作用，研究者在 NRVMs 中敲低 PGC-1α。結果顯示，Ang II 可增加 P62 水平并降低 LC3-II/LC3-I 比值，而 FAN 能逆轉這些變化。然而，PGC-1α 敲低明顯削弱 FAN 的保護效應，說明 FAN 通過 PGC-1α 恢復自噬通量。進一步的免疫熒光共定位實驗顯示，FAN 處理顯著增強 LC3 與線粒體蛋白 TOM20 的共定位信號。線粒體膜電位（Δψm）是反映細胞健康狀況的重要指標，JC-1 染色顯示 Ang II 誘導 Δψm 去極化，表現為綠色熒光增強；而 FAN 共處理可明顯減輕這一變化，提示其能夠保護線粒體功能。總體而言，這些結果表明，FAN 可通過激活 PGC-1α，減輕 Ang II 誘導的氧化應激、線粒體功能障礙和自噬通量受損。

圖7：粉防己堿（FAN）在 Ang II 誘導的新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）中，通過激活 PGC-1α 通路改善線粒體功能障礙和自噬受損。（a）ROS 生成及相應熒光強度的代表性圖像。（b）NRVMs 中 P53、P21、AMPK、p-AMPK、PGC-1α 和 SIRT1 的代表性 Western blot 分析結果。GAPDH 作為上樣內參。（c–g）使用 ImageJ 對 B 圖中蛋白條帶強度進行定量分析。（h）NRVMs 中 SIRT1 的免疫熒光染色。免疫反應顯示為紅色。細胞用 DAPI 復染（藍色）（比例尺 = 100 μm）。（i）NRVMs 中 ULK1、p-ULK1、P62、mTOR、p-mTOR 和 LC3 的代表性 Western blot 分析結果。GAPDH 作為上樣內參。（j–m）使用 ImageJ 對 I 圖中蛋白條帶強度進行定量分析。（n）代表性免疫熒光圖像顯示 NRVMs 中 LC3（綠色）與 TOM20（紅色）的共定位。細胞核用 DAPI 復染（藍色）（比例尺 = 100 μm）。（o）JC-1 染色及熒光強度的代表性圖像（比例尺 = 100 μm）。所有定量數據均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，與 CON 組相比； < 0.05，與 Ang II 組相比。

FAN 可直接結合 PGC-1α 并促進 STAT6-PGC-1α 相互作用

為確定 FAN 的直接分子靶點并闡明其作用機制，研究者開展了系統性的結合和相互作用分析。分子對接結果顯示，FAN 可與 AMPK、SIRT1 和 PGC-1α 結合，其中與 PGC-1α 的結合最穩定，結合能為 ?7.5 kcal mol?1。藥物親和反應靶點穩定性實驗（DARTS）顯示，FAN 處理可改變細胞裂解液中 PGC-1α 對蛋白酶的敏感性，提示 FAN 可直接結合 PGC-1α。

細胞熱遷移實驗（CETSA）是一種可在完整細胞中檢測配體或藥物結合導致蛋白穩定性變化的生物物理技術。結果顯示，FAN 處理細胞中 PGC-1α 顯著穩定，提示 FAN 可直接作用于 PGC-1α。表面等離子共振（SPR）實驗進一步證實，FAN 能夠以較強親和力直接結合 PGC-1α。研究者還在心肌細胞中進行了共免疫沉淀（Co-IP）實驗，結果證明內源性 STAT6 與 PGC-1α 在基礎狀態下存在直接物理相互作用，而 FAN 處理可顯著促進 STAT6-PGC-1α 相互作用。

圖8：粉防己堿（FAN）促進 STAT6-PGC-1α 相互作用。（a）FAN 與 AMPK 的分子對接。（b）FAN 與 SIRT1 的分子對接。（c）FAN 與 PGC-1α 的分子對接。（d）藥物親和反應靶點穩定性（DARTS）實驗顯示，FAN 處理增加細胞裂解液中 PGC-1α 對蛋白酶的敏感性。（e）使用 ImageJ 軟件對相應蛋白條帶強度進行定量分析。（f）新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）用 6 μM FAN 處理2小時，隨后在不同溫度下加熱3分鐘。經凍融循環裂解細胞后，通過 Western blot 檢測可溶性 PGC-1α 蛋白水平。（g）FAN 與 PGC-1α 之間的表面等離子共振（SPR）分析。（h）在轉染 Flag-PGC-1α 的 NRVMs 中，使用抗 Flag 抗體進行共免疫沉淀（Co-IP）實驗，隨后通過免疫印跡檢測其與 STAT6 的結合。IgG 作為 Co-IP 陰性對照。（i）使用抗 PGC-1α 抗體進行免疫沉淀后，對輸入樣本和 Co-IP 樣本進行免疫印跡，并檢測 STAT6。GAPDH 作為輸入裂解液的上樣內參。所有定量數據均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，與 CON 組相比；ns = 與 CON 組相比無顯著性差異。

PGC-1α 通過調節 GPX4/ACSL4 通路影響 Ang II 誘導的心肌細胞凋亡和鐵死亡相關損傷

為明確激活 PGC-1α 是否足以模擬并介導 FAN 的完整心臟保護作用，研究者在 NRVMs 中進行了 PGC-1α 過表達實驗。與對照組相比，Ang II 處理誘導典型的鐵死亡超微結構特征，包括線粒體電子密度明顯升高、嵴結構紊亂以及膜完整性喪失。值得注意的是，在 Ang II 刺激前過表達 Flag-PGC-1α 可阻止這些超微結構損傷。更重要的是，FAN 與 PGC-1α 過表達聯合處理并未產生進一步的協同保護作用。

Western blot 分析一致顯示，PGC-1α 過表達可有效逆轉 Ang II 誘導的鐵死亡相關蛋白異常，包括 GPX4、CCBR1、SLC40A1 和 ACSL4。類似地，在 PGC-1α 過表達細胞中加入 FAN 后，并未進一步顯著調節這些蛋白水平。GPX4 免疫熒光染色進一步證實，在 Ang II 刺激下，PGC-1α 過表達可完全維持心肌細胞中 GPX4 的高表達水平，聯合處理沒有額外優勢。流式細胞術分析凋亡也與上述結果一致：Ang II 誘導顯著凋亡，而 PGC-1α 過表達完全阻斷了這一過程，二者聯合并未提供額外保護。

總體而言，這些結果表明，PGC-1α 的激活不僅是 FAN 發揮核心保護作用所必需的，而且足以完整復現 FAN 的主要保護效應。當 PGC-1α 已被充分激活時，額外給予 FAN 不再產生顯著增量保護作用。這進一步確認 PGC-1α 是 FAN 抑制鐵死亡并保護心肌細胞的核心下游樞紐，其作用主要通過 PGC-1α 激活及其對 GPX4/ACSL4 通路的調控實現。

圖9：PGC-1α 通過調節 GPX4/ACSL4 通路影響 Ang II 誘導的心肌細胞凋亡。（a）使用 Flag-PGC-1α 在新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）中過表達 PGC-1α。對照轉染采用空載體（EV）質粒。PGC-1α 過表達后，細胞在暴露于 Ang II（1 μM）2小時之前，先用或不用 10 μM FAN 預處理1小時。圖中顯示代表性透射電子顯微鏡（TEM）圖像。（b）NRVMs 中 GPX4、CCBR1、SLC40A1 和 ACSL4 的代表性 Western blot 分析結果。GAPDH 作為上樣內參。（c–f）使用 ImageJ 對 B 圖中蛋白條帶強度進行定量分析。（g）NRVMs 中 GPX4 的免疫熒光染色。免疫反應顯示為綠色。細胞用 DAPI 復染（藍色）（比例尺 = 100 μm）。（h）代表性流式細胞術圖像。所有定量數據均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，與 CON 組相比； < 0.05，與 Ang II 組相比。

STAT6 作為轉錄因子促進 PPARγ 表達

已有研究提示，STAT6 轉錄因子可在巨噬細胞中促進 PPARγ 通路激活。為進一步考察 STAT6 調控的下游基因，研究者發現 STAT6 可促進 PPARγ 基因表達，而 FAN 可通過抑制 STAT6 下調 PPARγ 表達。利用 JASPAR 數據庫預測發現，PPARγ 啟動子區域存在 STAT6 結合位點。

雙熒光素酶報告實驗顯示，STAT6 可增強 PPARγ 的熒光素酶活性，而 FAN 可通過抑制 STAT6 表達降低這種活性。為確定 STAT6 在 PPARγ 啟動子中的具體結合位點，研究者構建了不同截短長度的 PPARγ 啟動子質粒。結果顯示，STAT6 對 PPARγ 啟動子活性的調控取決于其與 ?1008 至 ?999 bp 區域位點的結合。進一步突變該區域結合位點后，STAT6 對 PPARγ 啟動子熒光素酶活性的影響被消除。ChIP 實驗進一步證實，STAT6 能夠結合 PPARγ 啟動子 ?1008 至 ?999 bp 區域。綜上，PPARγ 是 STAT6 的下游調控基因。

圖10：轉錄因子 STAT6 促進 PPARγ 表達。（a）實時 qPCR 分析顯示 PPARγ 的 mRNA 水平。（b）利用在線轉錄因子預測軟件 JASPAR 獲得 STAT6 與 PPARγ 啟動子區域之間的潛在結合序列。（c）在新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）中，共轉染含有 PPARγ 啟動子序列的熒光素酶報告質粒和 STAT6 過表達質粒，并在有或無 10 μM FAN 條件下檢測相對熒光素酶活性。（d）在 NRVMs 細胞中，共轉染含有不同截短 PPARγ 啟動子序列的熒光素酶報告質粒和 STAT6 過表達質粒，并檢測相對熒光素酶活性。（e）PPARγ 在 ?1008 至 ?999 區域的突變序列及其熒光素酶活性。（f）通過 ChIP-qPCR 分析 STAT6 與 PPARγ 啟動子的結合。IgG 作為陰性對照。*P < 0.05， < 0.05，雙尾 Student's t 檢驗。

【貢獻】★★★★★

總之，粉防己堿（FAN）通過調控 PGC-1α/STAT6/PPARγ 信號軸，對 Ang II 誘導的心臟損傷發揮保護作用，從而將線粒體適應能力與鐵死亡性細胞死亡的調控聯系起來。這一整合機制進一步完善了當前對心力衰竭的理解，即在持續應激條件下，心肌細胞生存受到一個協調的“線粒體—轉錄調控網絡”支配。該研究的重要啟示在于，選擇性調節這一信號軸，可能比廣泛抑制上游神經體液信號更有利于精準控制細胞命運。未來研究需要進一步闡明該通路在人類心肌中的層級結構和時間性激活規律，并驗證調控該通路是否能在不同心力衰竭亞型中帶來一致獲益。總體來看，靶向匯聚性調控節點，而不是孤立通路，可能是推進心力衰竭治療策略發展的更有效方向。

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