大名鼎鼎的蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）,它功能強大，卻在實驗設(shè)計和優(yōu)化上極其挑剔。今天我們將介紹蛋白質(zhì)免疫印跡相對定量所需的標準化方法和上樣對照 —— 以及為什么你需要謹慎依賴所謂的 “管家蛋白”。

對蛋白質(zhì)免疫印跡進行絕對定量需要使用目的蛋白（POI）的純品制作標準曲線。這種方法結(jié)果可靠，但在很多情況下屬于過度操作。通常，你可能不需要知道目的蛋白的精確含量，只需了解其濃度是否會隨實驗參數(shù)變化而改變。這正是半定量蛋白質(zhì)免疫印跡的用武之地。

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)免疫印跡實驗都能從陽性對照 —— 也就是上樣對照中獲益，這類對照蛋白在凝膠的每一個泳道中都必然存在。最基礎(chǔ)的作用是，上樣對照能幫你排除加樣不均、膜轉(zhuǎn)印異常等實驗誤差。

文中展示了多泳道蛋白質(zhì)免疫印跡的示意圖。第一張印跡沒有上樣對照，第 1、2、4 泳道有條帶，第 3 泳道沒有。圖注寫道：“是第 3 組實驗條件完全消除了我的目的蛋白，還是我不小心漏加了一個泳道？” 一個分叉箭頭從該圖指向兩個加入上樣對照的可能結(jié)果（圖 2 和圖 3）。圖 2 顯示目的蛋白的條帶模式與第一張圖一致，同時四個泳道均出現(xiàn)上樣對照條帶，圖注為：“這絕對是真實的實驗效應！” 圖 3 中目的蛋白的條帶模式不變，但第 3 泳道既沒有目的蛋白條帶，也沒有上樣對照條帶，圖注為：“哎呀，搞砸了！”

圖 1：上樣對照是一種用于證明目的蛋白缺失的陽性對照，同時也有助于確認各泳道上樣量均勻。

對于半定量蛋白質(zhì)免疫印跡而言，上樣對照的重要性更為突出。沒有任何加樣槍能做到絕對精準，蛋白質(zhì)在整張膜上的轉(zhuǎn)印也不可能完全均勻。那么，如何才能準確比較不同泳道的結(jié)果呢？在相對定量中，需要將目的蛋白條帶的信號強度與同泳道的上樣對照進行標準化：用每個目的蛋白條帶的強度除以同泳道上樣對照條帶的強度，最終報告所得的比值。

文中展示了兩張蛋白質(zhì)免疫印跡示意圖，以及對應的數(shù)學標準化柱狀圖。條帶按灰度分為淺灰、中灰和深灰三個等級。兩張印跡均包含兩個實驗條件，每個條件下都有目的蛋白條帶和上樣對照條帶。在兩張印跡中，條件 1 的目的蛋白條帶均為淺灰，條件 2 的目的蛋白條帶均為中灰。左側(cè)印跡中，兩個條件的上樣對照條帶均為深灰。標準化后的數(shù)值以柱狀圖呈現(xiàn)，條件 1 的淺灰條帶強度除以深灰上樣對照強度，所得數(shù)值小于條件 2 的中灰條帶強度除以深灰上樣對照強度。右側(cè)印跡中，條件 1 的上樣對照條帶為中灰，條件 2 的上樣對照條帶為深灰。標準化后的數(shù)值顯示，條件 1 的淺灰條帶強度除以中灰上樣對照強度，與條件 2 的中灰條帶強度除以深灰上樣對照強度的結(jié)果相等。

圖 2：使用上樣對照進行標準化。每個泳道下方標注了目的蛋白條帶與上樣對照條帶的強度比值。左側(cè)凝膠的上樣對照條帶強度一致，因此標準化后的數(shù)值直接反映了目的蛋白條帶的強弱差異。右側(cè)凝膠的目的蛋白條帶與左側(cè)完全相同，但由于條件 1 的上樣對照條帶弱于條件 2，最終兩個條件的標準化數(shù)值相等。

這種標準化方法幾乎是通用的實驗手段，但使用時務必謹慎！上樣對照只能解決影響蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果的一類誤差，過度依賴標準化反而可能放大實驗設(shè)計和凝膠定量過程中的其他誤差。

圖 3：在理想情況下，樣品中的蛋白質(zhì)濃度與膜上的蛋白豐度直接相關(guān)，而膜上的蛋白豐度又能通過條帶強度準確反映。研究人員通過這一鏈條的后續(xù)環(huán)節(jié)（藍色）來推斷或計算前期環(huán)節(jié)的信息。但在實際操作中，多種誤差來源（紅色）會影響這些關(guān)聯(lián)，必須通過不同的對照實驗（綠色）來解決。

研究人員常常默認上樣對照不受其他誤差來源的影響。對于你所開展的特定實驗和所選的上樣對照，驗證這些假設(shè)是否成立至關(guān)重要。首先，我們來分析為什么這些假設(shè)是準確使用上樣對照的核心。

假設(shè) 1：上樣對照的表達不受實驗條件干擾

上樣對照的作用本就是校正上樣誤差。當用它來標準化實驗結(jié)果時，你默認上樣對照條帶的所有差異都源于上樣和轉(zhuǎn)印誤差 —— 而非蛋白上膠前的任何實驗因素。

但如果你的實驗在不知情的情況下改變了上樣對照的表達水平呢？如果假設(shè) 1 不成立，那么目的蛋白標準化后強度的任何變化，既可能是目的蛋白本身的真實變化，也可能是上樣對照發(fā)生了相反變化導致的假象。

假設(shè) 2：上樣對照能夠被準確定量

在蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中，蛋白豐度與條帶強度之間呈 S 型曲線關(guān)系。豐度過低的蛋白可能無法被檢測到，而豐度過高的蛋白則會使檢測器達到飽和。在這兩個極端之間，才是線性檢測范圍。

圖中展示了一幅示意圖，橫軸為 “蛋白豐度”，縱軸為 “條帶強度”。兩者的關(guān)系以 S 型曲線表示，曲線的線性部分已被標注。

圖 4：實驗的線性檢測范圍位于兩條虛線之間。

要理解這種 S 型關(guān)系為何會給豐度差異極大的蛋白定量帶來問題，我們來看下面這個凝膠示例。

圖中展示了一幅蛋白質(zhì)免疫印跡示意圖，包含兩個實驗條件，每個條件下均有目的蛋白條帶和上樣對照條帶。這四個條帶也分別以彩色點的形式標注在圖 4 所示的蛋白豐度 - 條帶強度 S 型曲線上。條件 1 中，目的蛋白條帶為淺灰，上樣對照條帶為深灰；條件 2 中，目的蛋白條帶為中灰，上樣對照條帶為極深灰。僅憑肉眼很難區(qū)分兩個上樣對照條帶的顏色差異，但仔細觀察確實存在不同。這一點在 S 型曲線圖上也得到了體現(xiàn)：目的蛋白條帶均落在線性檢測范圍內(nèi)，條件 2 的蛋白豐度更高，條帶強度也相應更高；而兩個上樣對照條帶均超出了線性檢測范圍，處于 S 型曲線的平臺期。盡管條件 2 的上樣對照蛋白豐度更高，但其條帶強度與條件 1 幾乎沒有差別。

圖 5：左側(cè)為示例凝膠，右側(cè)為對應條帶在蛋白豐度 - 條帶強度曲線上的位置。

在這張凝膠上，“條件 1” 的目的蛋白條帶明顯比 “條件 2” 淺。僅憑肉眼觀察，兩個條件的上樣對照條帶看起來幾乎一致，但事實并非如此！（我保證，真的不一樣。）這種直觀的定性解讀會產(chǎn)生誤導性結(jié)論。

從 S 型曲線中我們能清楚看到原因：在蛋白豐度軸上，條件 1 的兩個點（目的蛋白和上樣對照）都比條件 2 對應的點小相同的數(shù)值。對于兩個實心的目的蛋白點，這種豐度差異能在條帶強度軸上準確反映出來；但上樣對照的點超出了線性檢測范圍，因此它們在條帶強度軸上的數(shù)值幾乎相等。

這種效應不僅會導致錯誤的定性結(jié)論，對計算機定量分析也同樣存在問題。在線性檢測范圍之外，條帶強度的測量結(jié)果極易產(chǎn)生誤差，因為強度的微小變化可能對應著蛋白豐度的巨大差異。

不同上樣對照的假設(shè)驗證

那么，如何在不做出錯誤假設(shè)的前提下解決這些誤差問題呢？答案取決于你選擇的上樣對照類型。

管家蛋白作為上樣對照

β- 肌動蛋白（β-actin）、甘油醛 - 3 - 磷酸脫氫酶（GAPDH）等廣泛表達的蛋白是常用的上樣對照，這類蛋白被稱為 “管家蛋白”，與目的蛋白一樣，通過特異性抗體進行檢測。

這種方法非常普遍，我們前面的示意圖也都采用了這種方式。然而，它同時對上述兩個假設(shè)提出了挑戰(zhàn)。

假設(shè) 1：上樣對照的表達不受實驗條件干擾

遺憾的是，多項研究表明，常見的管家蛋白會受到多種實驗條件的影響（Ghosh 等人，2014）。盡管在很多情況下這一假設(shè)可能成立，但你仍需針對自己的實驗體系進行驗證。

我們建議首先查閱文獻，了解你所選的管家蛋白在你的實驗背景下的表達情況。如果沒有相關(guān)報道，你需要開展對照實驗，證明該參考蛋白的表達在你的實驗條件下不會發(fā)生變化。否則，你可能需要考慮更換其他上樣對照。

假設(shè) 2：上樣對照能夠被準確定量

大多數(shù)管家蛋白在細胞中呈高豐度表達。這意味著，當樣品濃度調(diào)整到適合檢測低豐度目的蛋白的水平時，管家蛋白幾乎必然會出現(xiàn)上樣過載。有論文將這一問題稱為 “蛋白質(zhì)免疫印跡定量中最常見的錯誤”（Gilda & Gomes，2013）。

為解決這一誤差來源，必須確定實驗中所有待檢測蛋白的線性檢測范圍。線性檢測范圍受樣品濃度和抗體稀釋度的共同影響 —— 我們在之前關(guān)于蛋白質(zhì)免疫印跡的博客文章（1, 2）中已經(jīng)討論過這兩個因素。如果目的蛋白和上樣對照的豐度差異不大，它們的線性檢測范圍可能會有重疊，這樣就能在同一張印跡上對兩者進行準確定量。

總蛋白定量作為上樣對照

總蛋白定量是一種更準確的上樣對照替代方案?？偟鞍兹旧ɑ蛎馊境上裣到y(tǒng)都能有效檢測泳道中的總蛋白含量（Aldridge 等人，2008；Gilda & Gomes，2013）。根據(jù)所選方法的不同，上樣對照的檢測可以在目的蛋白免疫印跡之前或之后進行。

圖中展示了兩張蛋白質(zhì)免疫印跡示意圖。一張是目的蛋白印跡，包含兩個實驗條件，條帶強度不同；另一張是總蛋白檢測結(jié)果，整個泳道布滿了不同分子量和豐度的蛋白條帶，兩個條件的總蛋白信號幾乎完全一致。

圖 6：總蛋白定量在與最終印跡相同的凝膠或膜上進行（具體取決于所選方法）。通過對整個泳道的蛋白進行定量，可獲得用于標準化的上樣對照。

假設(shè) 1：上樣對照的表達不受實驗條件干擾

通過檢測泳道中的總蛋白，上樣對照不會受到任何單個蛋白意外表達變化的顯著影響。這能確保你真正比較的是目的蛋白占總樣品蛋白的比例變化。

假設(shè) 2：上樣對照能夠被準確定量

由于總蛋白檢測與目的蛋白免疫印跡是兩個獨立的步驟，你無需擔心多個靶標之間線性檢測范圍的沖突問題，非常便捷。

不同上樣對照方法的比較

示意圖固然直觀，但我們還是用 Gilda & Gomes 在 2013 年發(fā)表的真實實驗數(shù)據(jù)，來對比不同上樣對照方法的效果。

圖 7：使用不同上樣對照對肝臟裂解物進行半定量分析。A）用 β- 肌動蛋白抗體（1:2000）檢測 10–40 μg 肝臟裂解物的蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果，為三次獨立實驗的代表性結(jié)果。B–C）膜上 β- 肌動蛋白（B）或總蛋白（C）的相對強度與凝膠上樣蛋白量的關(guān)系圖（n=3），數(shù)據(jù)以平均值 ± 標準誤表示。改編自《Analytical Biochemistry》第 440 卷，Gilda, J. E. 與 Gomes, A. V. 發(fā)表的《免染總蛋白染色是比 β- 肌動蛋白更優(yōu)的蛋白質(zhì)免疫印跡上樣對照》，頁碼 186–188，版權(quán) 2013，經(jīng)愛思唯爾（Elsevier）許可使用。

在該圖中，A–B 面板展示了管家蛋白法的結(jié)果。僅憑肉眼很難在 A 圖中看出 β- 肌動蛋白條帶濃度隨上樣量增加而升高，而 B 圖的定量結(jié)果也顯示其線性關(guān)系不佳。

C 面板對比了兩種不同的總蛋白定量方法。雖然斜率越高表示靈敏度越高，但線性度才是上樣對照最重要的特性，兩種總蛋白定量方法均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。注意 B 和 C 面板的縱軸刻度不同，這表明 β- 肌動蛋白不僅線性度差，靈敏度也低于總蛋白定量法。這也解釋了為什么總蛋白定量通常是更準確的上樣對照選擇。

感謝你和我們一起探索蛋白質(zhì)免疫印跡的標準化方法。祝你的實驗條帶清晰，檢測范圍始終在線性區(qū)間！

參考文獻

Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., & Weiler, I. J. (2008). The use of total protein stains as loading controls: An alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. Journal of Neuroscience Methods, 172(2), 250–254. https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2008.05.003

Ghosh, R., Gilda, J. E., & Gomes, A. V. (2014). The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics, 11(5), 549–560. https://doi.org/10.1586/14789450.2014.939635

Gilda, J. E., & Gomes, A. V. (2013). Stain-Free total protein staining is a superior loading control to β-actin for Western blots. Analytical Biochemistry, 440(2), 186–188. https://doi.org/10.1016/j.ab.2013.05.027

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