2026年5月，上海交通大學醫學院附屬上海市第一人民醫院范能廣、彭永德、劉芳團隊，聯合上海中醫藥大學附屬龍華醫院、上海市松江區中心醫院、上海交通大學醫學院附屬上海市第一人民醫院臨床藥學科、消化內科、肝膽外科及臨床研究中心等單位，在Metabolism（中科院醫學1區，2024 Impact Factor=11.9）在線發表題為 “KCMF1 promotes MASLD progression via K48-linked ubiquitination and degradation of AMPKα” 的研究論文。該文于2025年12月7日投稿，2026年5月17日接收。

代謝功能障礙相關脂肪性肝?。∕ASLD）目前仍缺乏有效藥物治療。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是維持肝臟能量代謝穩態的重要分子，在促進脂肪酸氧化、抑制脂質生成和減輕肝臟代謝損傷方面具有關鍵作用。然而，在MASLD中，AMPK蛋白水平和活性下降的上游調控機制尚未完全明確。

本研究通過整合MASLD差異蛋白質組學與AMPKα互作組分析，發現鉀通道調節因子1（KCMF1）是在MASLD肝臟中顯著上調、并可與AMPKα相互作用的E3泛素連接酶。進一步機制研究顯示，KCMF1可直接結合AMPKα，促進其發生K48連接的多聚泛素化，從而加速AMPKα降解并抑制肝臟AMPK信號通路。

在多種動物模型和原代肝細胞實驗中，肝臟KCMF1過表達可加重脂肪變性、炎癥和纖維化；相反，KCMF1敲低或肝細胞特異性敲除可改善HFD、GAN、CDAHFD及ob/ob等MASLD/MASH模型中的代謝紊亂和肝臟病理損傷。藥理學干預進一步證明，KCMF1的促病作用依賴AMPK信號抑制：AMPK激活可減輕KCMF1誘導的病理改變，而AMPK抑制則削弱KCMF1缺失帶來的保護作用。

值得關注的是，研究團隊還結合AI引導的虛擬篩選和生物物理學驗證，鑒定出黃酮類化合物 rhoifolin 可直接結合KCMF1，穩定AMPKα并恢復AMPK信號，從而在小鼠MASH模型中改善肝臟脂質積累、炎癥浸潤和纖維化。該研究揭示了 KCMF1–AMPK軸 是MASLD進展中新的翻譯后調控機制，也提示靶向KCMF1可能為MASLD/MASH治療提供新的干預方向。

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【摘要】

研究背景與目的：代謝功能障礙相關脂肪性肝?。∕ASLD）目前仍缺乏有效的藥物治療方案。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是重要的代謝調控因子，具有肝臟保護作用，但在MASLD中，調控AMPK降解的上游機制仍不清楚。本研究鑒定出鉀通道調節因子1（KCMF1）是一種此前未被認識到的、可靶向AMPKα的E3泛素連接酶，并進一步探討其在MASLD發病過程中的作用。

研究方法：研究通過共免疫沉淀和GST pull-down實驗分析蛋白相互作用；通過生物化學實驗評估泛素連接類型特異性以及AMPKα穩定性；在多種小鼠MASLD模型中，包括高脂飲食（HFD）、Gubra-Amylin NASH飲食（GAN）、膽堿缺乏L-氨基酸定義高脂飲食（CDAHFD）以及ob/ob模型，評估肝細胞靶向的功能獲得實驗和肝細胞特異性KCMF1缺失的影響；同時通過藥理學調控驗證其對AMPK通路的依賴性。研究還結合AI引導的虛擬篩選和生物物理學驗證，尋找候選KCMF1抑制劑。

研究結果：在小鼠和人MASLD肝臟的肝細胞中，KCMF1表達明顯上調。KCMF1能夠直接與AMPKα相互作用，并催化其K48連接的多聚泛素化，從而促進AMPKα降解并抑制肝臟AMPK信號通路。從功能上看，肝臟KCMF1過表達會加重脂肪變性、炎癥和纖維化；相反，KCMF1敲低或肝細胞特異性刪除可在多種MASLD模型中發揮保護作用。在體內和原代肝細胞中進行的雙向藥理學調控實驗進一步證明，該過程依賴AMPK通路：AMPK激活可減輕KCMF1驅動的病理改變，而AMPK抑制會削弱KCMF1缺失帶來的保護效應。此外，研究鑒定出黃酮類化合物rhoifolin可直接結合KCMF1，穩定AMPKα，并改善小鼠MASLD表型。

研究結論：KCMF1通過促進AMPKα發生K48連接的泛素化和降解，驅動MASLD發生發展。靶向KCMF1–AMPK軸可恢復肝臟代謝穩態，可能成為MASLD治療的潛在策略。

關鍵詞：鉀通道調節因子1；AMP活化蛋白激酶；代謝功能障礙相關脂肪性肝病；泛素化

01

研究背景及科學問題

代謝功能障礙相關脂肪性肝?。∕ASLD）是全球慢性肝病的重要原因之一，約影響全球40%的人群，并與肥胖和2型糖尿病患病率上升相伴出現。代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）是MASLD的進展形式，可進一步發展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝細胞癌，是肝病相關死亡的重要推動因素。MASH還與多種肝外并發癥有關，包括2型糖尿病、心血管疾病、認知功能下降以及慢性腎臟病。MASLD給醫療系統帶來沉重負擔，也推動社會經濟成本持續增加。然而，目前可用的藥物治療選擇仍然有限，亟需更有效的治療策略。因此，闡明MASLD發生發展的分子機制，對于開發靶向治療方案具有重要意義。

AMP活化蛋白激酶（AMPK）是細胞內重要的能量感受器，由含有催化亞基α1或α2，以及調節亞基β1或β2、γ1、γ2或γ3的異源三聚體復合物組成。在肝細胞中，AMPK激活可促進脂肪酸氧化，并抑制脂質生成和糖異生，因此在MASLD中具有肝臟保護作用。然而，在MASLD患者和實驗模型中，肝臟AMPK活性和蛋白水平下降，這會促進代謝紊亂和疾病進展。雖然AMPK活性通過磷酸化調控的機制已經被廣泛研究，AMPK激活劑也在MASLD臨床前模型中顯示出一定潛力，但其臨床應用受到脫靶效應限制。除磷酸化外，翻譯后泛素化逐漸被認為是決定代謝組織中AMPK蛋白穩定性和周轉的重要機制，例如骨骼肌中的MG53、脂肪組織中的MKRN1等。然而，在肝臟中，尤其是在MASLD背景下，負責AMPK泛素化和降解的特異性E3泛素連接酶仍大多尚未明確。填補這一機制空白，可能有助于發展新的MASLD靶向治療策略。

鉀通道調節因子1（KCMF1）是一種E3泛素連接酶，可與RAD6和UBR4形成獨特的E2-E3復合體，參與蛋白泛素化和降解。KCMF1被認為能夠識別具有未乙?；疦端的蛋白，并將其靶向降解，從而影響細胞穩態、壽命和運動能力。此外，KCMF1也被報道參與調控細胞增殖、遷移和侵襲，并與免疫反應及多種人類癌癥有關。盡管已有這些認識，KCMF1在代謝性肝病中的作用仍未被探索。

在本研究中，作者整合AMPKα互作組分析和MASLD差異蛋白質組學，發現KCMF1是在MASLD模型中顯著上調、并可與AMPKα相互作用的E3泛素連接酶。研究進一步證實，KCMF1可通過直接結合和K48連接的泛素化負向調控AMPKα，促進其降解。功能獲得和功能缺失實驗表明，KCMF1通過靶向AMPK信號通路，在體外和體內促進MASLD進展。此外，AI引導篩選發現rhoifolin是一種KCMF1抑制劑，可通過維持AMPKα穩定性和信號活性來減輕MASLD表型。這些發現揭示了KCMF1–AMPK軸是肝臟代謝調控中的新機制，并提示其可能成為MASLD的潛在治療靶點。

02

重要發現及亮點

KCMF1是MASLD中上調并富集于肝細胞的AMPKα互作E3泛素連接酶

為尋找在MASLD中介導AMPKα降解的E3泛素連接酶，研究者整合了高脂飲食小鼠肝臟差異蛋白質組數據，以及在HepG2和HEK293T細胞中進行的AMPKα1免疫沉淀-質譜（IP-MS）結果。高脂飲食數據集中共鑒定出25個差異表達的E3泛素連接酶，IP-MS則發現17個AMPKα1互作E3泛素連接酶。兩個數據集交集得到兩個候選分子：KCMF1和TRIM25。由于KCMF1上調更明顯，約為1.8倍，且此前其在肝臟代謝中的作用尚未被闡明，因此研究者將其作為后續重點研究對象。

進一步分析顯示，在高脂飲食小鼠、ob/ob小鼠以及GAN飲食小鼠肝臟中，KCMF1蛋白水平均明顯升高，而其mRNA水平并未發生顯著變化。免疫熒光結果顯示，高脂飲食小鼠肝細胞中KCMF1染色增強，并與肝細胞標志物肝細胞核因子4α（HNF4α）和白蛋白共定位，這與公共肝臟單細胞RNA測序數據一致。細胞類型特異性分析進一步顯示，游離脂肪酸（FFA）處理可選擇性上調小鼠原代肝細胞中的KCMF1表達，而對肝臟非實質細胞無明顯影響。與動物實驗一致，與對照組相比，MASLD患者肝臟中KCMF1蛋白水平也明顯升高?？傮w來看，這些結果表明，KCMF1是一個與AMPKα相互作用的E3泛素連接酶，在MASLD中穩定上調，并主要表達于肝細胞。

圖1：KCMF1在MASLD中上調并富集于肝細胞。（A）篩選策略示意圖：整合高脂飲食（HFD）小鼠肝臟差異蛋白質組數據，以及HepG2和HEK293T細胞中AMPKα1免疫沉淀-質譜（IP-MS）結果，用于鑒定候選E3泛素連接酶。（B，C）正常飲食（ND）和高脂飲食小鼠肝臟中KCMF1的代表性免疫印跡圖及定量分析，每組n=6。（D，E）12周齡野生型瘦小鼠（Lean）和ob/ob小鼠肝臟中KCMF1蛋白水平，每組n=5–8。（F，G）正常飲食和GAN飲食小鼠肝臟中KCMF1豐度，每組n=4。（H，I）經BSA或0.5 mM FFA處理24小時的原代肝細胞中KCMF1蛋白表達，每組n=3次獨立實驗。（J，K）經BSA或0.5 mM FFA處理24小時的肝臟非實質細胞中KCMF1蛋白表達，每組n=3次獨立實驗。（L，M）非脂肪變性或MASLD人肝臟樣本中KCMF1表達，每組n=4。數據以均數±SEM表示。ns表示無統計學意義；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

KCMF1促進AMPKα發生K48連接的泛素化和降解

在確認KCMF1可能與AMPKα相關后，研究者進一步驗證二者的相互作用。分子對接結果提示KCMF1可直接結合AMPKα；共免疫沉淀實驗顯示，KCMF1選擇性地與AMPK催化亞基AMPKα1和AMPKα2相互作用，而不與調節亞基AMPKβ1或AMPKγ1明顯結合。GST pull-down實驗進一步證實KCMF1與AMPKα之間存在直接結合。為明確結合區域，研究者構建了一系列KCMF1截短突變體。結果顯示，N端片段，即氨基酸1–60，不能與AMPKα1結合；而覆蓋中間區域和C端區域的片段，即61–151、152–224和225–381，仍保留結合能力，提示KCMF1的61–381位氨基酸對于其結合AMPKα是必要的。

隨后，研究者檢測KCMF1是否可促進AMPKα泛素化并影響其穩定性。結果顯示，KCMF1過表達顯著增加AMPKα泛素化；而刪除預測的催化區域，即78–101位氨基酸后，這一作用大幅減弱。泛素突變體實驗進一步顯示，K48R而非K63R突變可削弱KCMF1介導的AMPKα泛素化，說明這一過程具有K48連接特異性。蛋白穩定性實驗也顯示，KCMF1敲低可延長肝細胞中AMPKα半衰期，而KCMF1過表達則縮短其半衰期?？傮w而言，這些結果表明，KCMF1可直接靶向AMPKα，誘導其發生K48連接的泛素化，并促進其降解。

圖2：KCMF1與AMPKα相互作用并促進其泛素化和降解。（A）KCMF1與AMPKα的預測分子對接模型。（B）在HepG2細胞中，Flag-KCMF1與內源性AMPKα1、AMPKα2、AMPKβ1和AMPKγ1的共免疫沉淀（Co-IP）分析。（C，D）在HEK293T細胞中，通過Co-IP檢測Flag-KCMF1與Myc-AMPKα1之間的相互作用。（E）使用純化的GST-KCMF1和His-AMPKα1進行GST pull-down實驗；單獨GST作為對照。（F）全長KCMF1和截短KCMF1構建體示意圖。（G）在HEK293T細胞中，通過Co-IP分析Myc-AMPKα1與全長或截短Flag-KCMF1構建體之間的相互作用。（H）在共同轉染Flag-KCMF1、Myc-AMPKα和HA-Ub的HEK293T細胞中，通過免疫沉淀和免疫印跡檢測AMPKα泛素化。（I）在轉染全長KCMF1或KCMF1突變體（Δ78–101 aa）的HEK293T細胞中檢測AMPKα泛素化。（J）在HEK293T細胞中，使用HA-Ub、HA-Ub/K48R或HA-Ub/K63R突變體檢測KCMF1介導的AMPKα泛素化。（K–N）在經環己酰亞胺（CHX，50 μg/mL）處理的THLE-2細胞中，檢測KCMF1敲低或過表達對AMPKα蛋白穩定性的影響。

KCMF1促進原代肝細胞脂質積累和炎癥反應

在明確KCMF1可促進AMPKα降解后，研究者繼續在小鼠原代肝細胞中評估其功能。腺病毒介導的KCMF1敲低顯著減輕FFA誘導的脂質積累，表現為油紅O染色減少和細胞內甘油三酯含量降低。同時，脂質生成相關基因CD36、FASN、SCD1以及促炎介質IL-1β、IL-6、TNFα的表達也下降。與其對AMPKα穩定性的影響一致，KCMF1敲低增加AMPKα蛋白水平，并增強AMPKα Thr172位點及其下游靶點ACC Ser79位點的磷酸化。

相反，KCMF1過表達會加重FFA誘導的肝細胞脂肪變性和甘油三酯積累，并上調脂質生成和炎癥相關基因表達。同時，KCMF1過表達降低AMPKα蛋白水平，并減少AMPKα Thr172和ACC Ser79的磷酸化。上述結果提示，KCMF1是調控肝細胞脂質代謝和炎癥反應的重要分子，其作用與AMPK信號抑制密切相關。

圖3：KCMF1促進原代肝細胞脂質積累和炎癥反應。（A）原代肝細胞中KCMF1敲低實驗設計示意圖。（B，C）原代肝細胞中KCMF1敲低效率驗證。（D）轉導表達shGFP或shKCMF1腺病毒、并經BSA或FFA處理24小時的原代肝細胞代表性油紅O染色圖。（E）各組細胞甘油三酯（TG）含量。（F）原代肝細胞中脂質代謝相關基因CD36、FASN、SCD1以及炎癥基因IL-1β、IL-6、TNFα的mRNA表達。（G–H）各組AMPK信號通路免疫印跡分析及蛋白水平定量。（I）原代肝細胞中KCMF1過表達實驗設計示意圖。（J，K）原代肝細胞中KCMF1過表達效率驗證。（L）轉導表達GFP或KCMF1腺病毒、并經BSA或FFA處理24小時的原代肝細胞代表性油紅O染色圖。（M）各組細胞TG含量。（N）原代肝細胞中脂質代謝相關基因CD36、FASN、SCD1以及炎癥基因IL-1β、IL-6、TNFα的mRNA表達。（O–P）各組AMPK信號通路免疫印跡分析及蛋白水平定量。數據以均數±SEM表示，每組n=3次獨立實驗。比例尺為100 μm。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

肝臟特異性KCMF1缺失改善飲食誘導和遺傳性MASLD

為研究KCMF1在體內MASLD中的作用，研究者采用AAV8-shRNA在正常飲食或高脂飲食16周的小鼠中進行肝臟特異性KCMF1敲低，并通過Western blot確認KCMF1在肝臟中被有效降低。結果顯示，在正常飲食條件下，KCMF1敲低影響較??；但在高脂飲食挑戰下，KCMF1敲低可明顯改善代謝指標。盡管體重相近，高脂飲食條件下KCMF1缺失小鼠的空腹血糖降低，葡萄糖耐量和胰島素敏感性改善，血清脂質譜也得到改善。

在肝臟層面，KCMF1敲低可降低ALT和AST水平，提示肝損傷減輕；同時顯著減少肝臟甘油三酯和膽固醇積累。組織學分析進一步證實，KCMF1缺失小鼠肝臟脂肪變性減輕。分子檢測顯示，KCMF1缺失抑制了脂質攝取和脂質生成相關基因CD36、FABP1、FATP1、FASN、PPARγ、SCD1、SREBP-1c，以及促炎介質IL-1β、IL-6、TNFα的表達。

為驗證這一發現，研究者還在ob/ob小鼠中進行AAV介導的KCMF1敲低。結果顯示，在體重無顯著變化的情況下，葡萄糖穩態和胰島素敏感性同樣得到改善；肝臟脂肪變性和脂質積累明顯減少，并伴隨脂質生成和炎癥相關基因表達下降。這些數據共同說明，肝臟KCMF1缺失可緩解飲食誘導和遺傳性MASLD。

圖4：肝臟特異性KCMF1缺失在體內改善MASLD。（A）實驗設計和AAV8介導的肝臟特異性KCMF1敲低示意圖。（B，C）肝組織中KCMF1敲低效率的免疫印跡分析及定量。（D，E）各組小鼠體重和空腹血糖水平，每組n=6。（F，G）葡萄糖耐量試驗（GTT）及對應曲線下面積（AUC），每組n=6。（H，I）胰島素耐量試驗（ITT）及對應AUC。（J–M）各組血清TG、TC、ALT和AST水平。（N，O）各組肝臟TG和TC含量。（P）各組肝組織切片代表性H&E染色和油紅O染色圖，比例尺為100 μm。（Q）肝組織中脂質攝取和脂質生成相關基因CD36、FABP1、FATP1、FASN、PPARγ、SCD1、SREBP-1c以及炎癥相關基因IL-1β、IL-6、TNFα的相對mRNA表達。數據以均數±SEM表示。與HFD AAV-shGFP組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；與ND AAV-shGFP組相比，<0.05，#<0.01。

為進一步驗證KCMF1在MASLD中的作用，研究者還通過AAV8介導的方式在正常飲食或高脂飲食16周的小鼠肝臟中過表達KCMF1。免疫印跡結果證實，KCMF1在肝臟中被有效過表達。與敲低結果相對應，KCMF1過表達在正常飲食條件下影響有限，但在高脂飲食挑戰下會加重代謝紊亂。盡管體重相近，KCMF1過表達小鼠出現空腹血糖升高、葡萄糖耐量和胰島素敏感性受損，以及血清脂質譜惡化。KCMF1過表達還促進肝損傷和肝臟脂質積累，并增強肝臟脂質生成基因和炎癥基因表達。這些功能獲得實驗進一步支持KCMF1在MASLD中的關鍵作用。

KCMF1驅動MASH模型中的脂肪性肝炎進展

在明確KCMF1參與肝臟脂肪變性后，研究者進一步評估其在脂肪性肝炎中的作用。小鼠接受AAV8-shKCMF1或對照載體處理，隨后給予GAN飲食16周，并實現有效的肝臟KCMF1敲低。盡管體重未發生明顯改變，KCMF1缺失顯著緩解GAN誘導的脂肪性肝炎。具體表現為：空腹血糖以及循環甘油三酯和膽固醇水平降低；ALT和AST下降，提示肝損傷減輕；肝臟組織病理改善，脂肪變性和巨噬細胞浸潤減少。與此同時，脂質代謝相關基因CD36、SCD1、PPARγ、SREBP-1c，炎癥相關基因IL-1β、IL-6、MCP1，以及纖維化相關基因MMP13的表達均顯著下降。相反，肝臟KCMF1過表達會加重GAN飲食誘導的MASH，表現為代謝指標惡化、肝損傷加重，以及肝臟脂肪變性和炎癥增強。

圖5：肝臟KCMF1敲低緩解GAN飲食誘導的脂肪性肝炎。（A）AAV8介導的肝臟KCMF1敲低及GAN飲食喂養方案示意圖。（B，C）肝組織中KCMF1敲低效率的免疫印跡分析及定量。（D，E）各組體重和空腹血糖水平，每組n=6。（F–I）各組血清TG、TC、ALT和AST水平。（J）肝組織切片代表性H&E染色、油紅O染色、F4/80染色和CD11b染色圖，比例尺為100 μm；每組n=6。（K）肝組織中脂質代謝相關基因CD36、SCD1、PPARγ、SREBP-1c，炎癥相關基因IL-1β、IL-6、MCP1，以及纖維化相關基因MMP13的相對mRNA表達，每組n=6。數據以均數±SEM表示。ns表示無統計學意義；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

為進一步判斷這些作用是否由肝細胞內在機制介導，研究者構建了肝細胞特異性KCMF1敲除小鼠，并給予另一種經典MASH模型飲食CDAHFD。結果確認KCMF1被有效刪除。值得注意的是，肝細胞特異性KCMF1缺失顯著減輕CDAHFD誘導的脂肪性肝炎，表現為肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化減少，同時伴隨血清脂質水平和肝損傷指標下降。分子分析進一步顯示，脂質生成相關基因FASN、SCD1、SREBP-1c，炎癥相關基因IL-1β、IL-6，以及纖維化相關基因COL1A1、COL3A1、MMP9、MMP13、TIMP1均下調。上述結果說明，肝細胞來源的KCMF1參與脂肪性肝炎進展。

圖6：肝細胞特異性KCMF1缺失減輕CDAHFD誘導的脂肪性肝炎。（A）肝細胞特異性KCMF1敲除及CDAHFD喂養方案示意圖。（B，C）肝組織中KCMF1刪除效率驗證。（D，E）各組體重和空腹血糖水平，每組n=6。（F–I）各組血清TG、TC、ALT和AST水平，每組n=6。（J）肝組織切片代表性H&E染色、油紅O染色、F4/80染色、CD11b染色和Sirius Red染色圖，比例尺為100 μm。（K）肝組織中脂質代謝相關基因FASN、SCD1、SREBP-1c，炎癥相關基因IL-1β、IL-6，以及纖維化相關基因COL1A1、COL3A1、MMP9、MMP13、TIMP1的相對mRNA表達，每組n=6。數據以均數±SEM表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

KCMF1通過抑制肝臟AMPK信號促進MASLD進展

為探索KCMF1發揮作用的分子機制，研究者對高脂飲食條件下有無KCMF1敲低的小鼠肝臟進行RNA測序分析。KEGG通路富集結果顯示，在KCMF1缺失后，AMPK信號通路是顯著上調的通路之一。基因集富集分析也顯示，KCMF1缺失可激活與AMPK相關的代謝程序，包括脂肪酸降解和胰島素信號通路，同時抑制NF-κB和MAPK等炎癥相關通路。

隨后，研究者在蛋白水平檢測AMPK信號。在高脂飲食小鼠中，KCMF1敲低增加總AMPKα蛋白豐度，并伴隨AMPKα Thr172位點及其下游靶點ACC1磷酸化升高，但p-AMPK/總AMPK比值并無顯著變化。相比之下，AMPKβ1和AMPKγ1水平未受影響。相反，KCMF1過表達降低總AMPKα蛋白水平，并同步降低AMPKα和ACC1磷酸化，但不影響p-AMPK/總AMPK比值，也不影響AMPKβ1和AMPKγ1水平。類似的調控模式也出現在GAN飲食小鼠以及CDAHFD喂養的肝細胞特異性KCMF1敲除小鼠中。

與AMPK調控結果一致，KCMF1缺失增強肝臟脂肪酸氧化，表現為脂肪酸氧化（FAO）活性升高，以及PPARα、CPT-1α和ACOX-1表達上調；而KCMF1過表達則呈相反趨勢。

為進一步確認AMPK參與KCMF1的作用，研究者在體外和體內進行了藥理學拯救實驗。在原代肝細胞中，使用AMPK激活劑A-769662可顯著減輕KCMF1過表達誘導的脂質積累。在體內，肝臟KCMF1過表達小鼠接受GAN飲食并給予AMPK激活劑AICAR處理。結果顯示，AICAR可明顯緩解KCMF1誘導的代謝紊亂，表現為葡萄糖穩態、血清脂質譜和肝損傷指標改善，并伴隨肝臟脂肪變性和巨噬細胞浸潤減少?？傮w來看，這些結果支持KCMF1通過抑制肝臟AMPK信號促進MASLD進展。

圖7：KCMF1通過抑制肝臟AMPK信號調控MASLD進展。（A）接受AAV-shGFP或AAV-shKCMF1處理的高脂飲食小鼠肝組織中差異表達基因火山圖。（B）差異表達基因KEGG通路富集分析氣泡圖。（C）顯示主要富集KEGG通路的弦圖。（D）NF-κB、MAPK、脂肪酸降解和胰島素信號通路等信號通路的基因集富集分析（GSEA）。（E，F）KCMF1敲低的高脂飲食小鼠肝臟中AMPK信號組分的蛋白表達及定量，每組n=6。（G，H）KCMF1過表達的高脂飲食小鼠肝臟中AMPK信號組分的蛋白表達及定量，每組n=6。（I，J）GAN飲食喂養、KCMF1敲低小鼠肝臟中AMPK信號組分的蛋白表達及定量，每組n=6。（K，L）GAN飲食喂養、KCMF1過表達小鼠肝臟中AMPK信號組分的蛋白表達及定量，每組n=6。（M，N）CDAHFD喂養的肝細胞特異性KCMF1敲除小鼠肝臟中AMPK信號組分的蛋白表達及定量，每組n=4。數據以均數±SEM表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

AI篩選發現KCMF1抑制劑rhoifolin可通過恢復AMPK信號改善MASH

基于KCMF1通過抑制AMPK信號促進MASLD進展的發現，研究者進一步提出：靶向KCMF1可能是一種潛在治療策略。為尋找潛在KCMF1抑制劑，研究者基于KCMF1蛋白結構建模，對小分子庫進行了AI驅動的虛擬篩選。排名前20的小分子隨后接受表面等離子共振（SPR）驗證，其中8個小分子與重組KCMF1表現出顯著結合能力。研究者進一步選擇黃酮類化合物rhoifolin進行深入研究。微量熱泳動（MST）證實rhoifolin可直接結合KCMF1；分子對接提示其可能與KCMF1的RING結構域相互作用，從而影響KCMF1的E3泛素連接酶功能。

在功能層面，rhoifolin可減少FFA刺激的原代肝細胞脂質積累，并伴隨AMPKα蛋白豐度和磷酸化增加，以及ACC1磷酸化增強，提示AMPK信號被激活。值得注意的是，在KCMF1缺失的肝細胞中，rhoifolin降低脂質積累的作用明顯減弱，支持rhoifolin至少部分通過靶向KCMF1發揮作用。

研究者隨后在CDAHFD誘導的MASH模型中評估rhoifolin的治療效果。小鼠先給予CDAHFD 4周以建立MASH病理改變，隨后在繼續CDAHFD的同時給予rhoifolin或溶媒處理4周。結果顯示，rhoifolin處理在不影響體重的情況下，可降低血清ALT和AST水平。組織學結果顯示，H&E染色和油紅O染色提示rhoifolin改善肝臟脂質積累；F4/80和CD11b免疫熒光以及Sirius Red染色則顯示，rhoifolin處理小鼠的巨噬細胞浸潤和肝纖維化減少。在分子水平，rhoifolin增加肝臟AMPKα蛋白豐度和磷酸化水平，并增強ACC1磷酸化，提示其可在體內恢復AMPK信號。

圖8：Rhoifolin靶向KCMF1并通過恢復AMPK信號緩解MASH。（A）采用表面等離子共振（SPR）篩選20種小分子與重組KCMF1蛋白的結合情況。響應單位（RU）表示結合親和力。具有顯著結合的小分子被突出顯示，以藍色圓點標記。（B）微量熱泳動（MST）分析rhoifolin與KCMF1的結合，顯示其呈濃度依賴性相互作用，計算得到的Kd為3.29±0.41 μM。（C）Rhoifolin的化學結構。（D）顯示rhoifolin與KCMF1相互作用的分子對接模型。（E）CDAHFD誘導MASH模型及rhoifolin處理方案示意圖。（F）各組體重，每組n=6。（G，H）各組血清ALT和AST水平。（I）肝組織切片代表性H&E染色、油紅O染色、F4/80染色、CD11b染色和Sirius Red染色圖，比例尺為100 μm。（J，K）CDAHFD喂養小鼠接受rhoifolin處理后，肝組織中KCMF1和AMPK信號組分的蛋白表達及定量。數據以均數±SEM表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

【貢獻】★★★★★

本研究鑒定出KCMF1–AMPK軸是MASLD中此前未被認識到的調控通路，并支持KCMF1可能成為潛在治療靶點。調控這一軸線可能恢復AMPK信號，改善MASLD的代謝異常和病理特征，從而為現有治療策略提供一種補充性思路。

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