浙江
多糖作為四大類生物大分子之一，一般被認為是由內質網和高爾基體合成的，經分泌途徑運輸至細胞膜或細胞外空間發揮它的功能。但是，它們在細胞核內的存在與作用長期以來未被認知。近日，中山大學丁俊軍教授團隊在國際頂尖期刊《Nature Cell Biology》在線發表了題為“Nuclear N-glycosylation maintains H3K9me3 heterochromatin and genomic stability”的研究論文。該工作系統揭示了細胞核內核膜蛋白存在N-糖基化修飾，并闡明了這一修飾在維持H3K9me3異染色質和基因組穩定性中的關鍵調控作用。中山大學丁俊軍/毛洋/西北大學孫士生為共同通訊作者。
研究團隊首先利用質譜技術和自主開發的StrucGP軟件，在小鼠全能樣干細胞、小鼠和人的胚胎干細胞、小鼠前誘導多能干細胞以及小鼠胚胎成纖維細胞這五種不同細胞類型的細胞核中，均鑒定到了內核膜蛋白上的N-糖基化修飾。他們發現，SUN1、SUN2、TMPO和LEMD3這四種內核膜蛋白可以被高甘露糖型的N-聚糖所修飾。免疫熒光和免疫電鏡實驗進一步證實，N-糖基化信號確實定位于內核膜區域。用PNGase F酶去除N-聚糖后，這些信號顯著減弱甚至消失，這為核內N-糖基化的存在提供了直觀的證據。
為了在全基因組范圍內研究N-糖基化的分布，丁俊軍團隊開發了一種名為GlycoChIP-seq的新技術。該方法利用凝集素ConA識別并結合N-糖基化，進而富集與之結合的染色質片段進行測序。分析結果顯示，N-糖基化顯著富集在核纖層相關結構域中，這些結構域是位于細胞核周邊的異染色質區域。有意思的是，N-糖基化信號與抑制性組蛋白修飾H3K9me3的分布高度重疊，約百分之二十的N-糖基化 peaks與H3K9me3 peaks重合。研究團隊通過藥物抑制整體N-糖基化，或者對內核膜蛋白TMPO的N-糖基化位點進行定點突變，兩種獨立的干預策略均導致細胞內H3K9me3水平顯著下降，并且下調的H3K9me3信號同樣富集在核纖層相關結構域中。
進一步的機制研究發現，N-糖基化缺失會削弱內核膜蛋白TMPO與組蛋白甲基轉移酶SETDB1之間的相互作用。SETDB1是催化H3K9me3修飾的關鍵酶。當N-糖基化受到抑制或TMPO的糖基化位點發生突變時，SETDB1從核膜區域解離，向核質內彌散分布。這種定位的改變直接導致了SETDB1依賴性的H3K9me3修飾在基因組特定區域尤其是LADs內減少。研究團隊觀察到，H3K9me3水平下降的區域中包含了大量LINE-1逆轉座子。LINE-1是一種能夠在基因組中“跳躍”的重復序列，通常被H3K9me3異染色質所沉默。然而，當N-糖基化受損后，LINE-1的轉錄水平則顯著上升，其逆轉座活性也隨之增強。而LINE-1的激活會引起DNA雙鏈斷裂，細胞內的γH2A.X焦點數量明顯增加，這表明基因組的穩定性受到了破壞。研究團隊還在小鼠胚胎成纖維細胞中驗證了上述現象。
此外，研究團隊還探索了這些核內N-糖基化的來源。他們發現，經典的內質網N-聚糖生物合成途徑參與了內核膜蛋白的糖基化過程。團隊發現使用衣霉素抑制脂聯寡糖的合成，或者用NGI-1抑制劑阻斷寡糖轉移酶的活性，以及敲低催化亞基STT3A，都能夠顯著減少內核膜上的N-糖基化信號和內核膜蛋白的糖基化水平。此外，負責內核膜蛋白在內質網中擴散的atlastin蛋白家族成員ATL2，以及參與核孔復合物轉運的多個核孔蛋白，對于N-糖基化信號正確定位到內核膜也至關重要。
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