細胞治療是繼小分子藥物、抗體藥物之后的第三代生物醫藥技術，已廣泛應用于腫瘤治療、再生醫學等核心領域，成為當下最具潛力的前沿治療手段。目前，CAR-T、MSC、TIL等多款細胞治療產品已在全球多個國家和地區獲批上市，為疑難疾病患者帶來了全新的治療方案。但在細胞治療標準化、產業化發展進程中，細胞計數這一基礎且核心的質控環節，始終是影響產品質量穩定性、生產重復性與臨床療效安全性的關鍵痛點與技術瓶頸。

2024年《Cell Transplantation》刊發的重磅綜述《Challenges of Cell Counting in Cell Therapy Products》，系統梳理了細胞治療產品生產質控中細胞計數的各類難點與核心問題，針對性總結了全套精度優化方案與標準化實施策略，為全球細胞治療行業的計數規范化、質量可控化發展提供了權威的理論支撐與實踐指引。

一、細胞計數：細胞治療質量控制的基石

細胞計數貫穿細胞治療產品全生產生命周期，覆蓋細胞分離、擴增培養、基因修飾、制劑制備、成品放行等全部核心工序，是細胞質控體系的核心基礎。精準的細胞計數，是評估細胞活率、產品純度、治療效價的核心依據，也是制定臨床給藥劑量的唯一標準。計數結果的精準度，直接關系臨床治療效果：劑量不足會導致治療無效，劑量過高則可能誘發嚴重的臨床不良反應，是保障細胞治療安全有效的核心前提。

盡管細胞計數技術歷經百年發展、迭代成熟，但2020年行業調研數據顯示，僅有18%的生物醫藥生產與研發人員，對自身開展的細胞活力檢測結果具備高度可信度。這一行業現狀充分說明，細胞計數本身存在極強的技術復雜性，疊加行業統一標準缺失、實操不規范等問題，成為制約行業高質量發展的共性難題。

圖1 細胞計數的復雜性、影響因素及優化策略總覽

二、細胞計數面臨的四大核心挑戰1. 細胞樣本的高度異質性

不同類型的治療細胞生物學特性差異顯著，這種天然的細胞異質性，是導致計數偏差的首要根源，具體體現在四大方面：

• 大小差異：MSC 直徑約 15-30μm，而 T 細胞僅 7-10μm

• 聚集傾向：iPSC 極易形成致密團塊，傳統計數方法難以準確拆分

• 活率差異：同一產品中不同細胞亞群的活率可能存在顯著差異

• 污染物干擾：細胞碎片、紅細胞、血小板等會嚴重干擾計數結果

細胞重懸體系中的培養基、洗滌液、冷凍保護劑等基質成分，會直接干擾熒光染色效果與細胞識別精度，是引發計數誤差的重要外部因素，核心影響如下：

• DMSO 干擾：2.5%-10% 的 DMSO 會降低 AO/PI 染色效率，使 MSC 活率被低估約 5%

• PBS 影響：使用 PBS 重懸新鮮 T 細胞會導致計數結果降低近 40%，改用培養基可完全消除這一偏差

• 鹽濃度效應：不同鹽濃度會影響熒光染料與 DNA 的結合能力

當前行業主流的細胞計數技術原理各異、適用場景不同、優缺點鮮明，暫無通用型“萬能計數方法”，需結合產品特性按需選擇，各技術核心差異如下表所示：

表1 主流細胞計數方法對比

4. 檢測場景差異化，精度要求不同

• 過程監測：要求快速、簡便，允許一定誤差

• 產品放行：要求極高的準確度和精密度，必須符合 GMP 要求

• 臨床研究：需要可追溯、可驗證的標準化方法

細胞計數無最優方法，只有最適配的方案。方法選型需摒棄單一維度判斷，結合多維度核心因素綜合考量：

• 細胞類型和特性

• 樣本基質和雜質情況

• 檢測目的和精度要求

• GMP 合規性需求

值得注意的是，不同檢測方法的結果偏差具有場景特異性。常規膜完整性檢測法（臺盼藍、AO/PI）普遍會高估凍后細胞活率，無法區分“細胞膜完整但已喪失增殖、治療功能”的受損細胞；而Alamar Blue、ATP等代謝活性檢測方法，可精準反映細胞的真實生理功能狀態，更適配凍后細胞活力的真實評估。

2. 精細化全流程管控，減少人為系統誤差

大量實操數據證實，細胞計數80%以上的誤差來源于樣本制備環節，通過標準化流程管控可大幅降低偏差，核心優化要點如下：

• 充分混勻：避免細胞沉降導致的取樣不均

• 控制稀釋度：確保計數區域內細胞數量在最佳范圍

• 規范染色：嚴格控制染色時間和染料濃度，避免臺盼藍的細胞毒性

• 儀器校準：定期進行 IQ/OQ/PQ 驗證，使用參考微球校準儀器

依據ICH Q2 (R2) 國際藥物研發指導原則，細胞計數作為細胞治療產品的核心檢測方法，必須完成全套方法學驗證，核心驗證指標包含：

• 特異性、準確度、精密度

• 線性、范圍、檢測限和定量限

• 耐用性

同時，ISO 20391-2行業標準明確了細胞計數方法的標準化驗證體系，通過梯度稀釋實驗設計，結合變異系數（CV）、決定系數（R2）、比例指數（PI）等核心統計學指標，可全方位評估計數方法的精準度、穩定性與適配性。

4. 搭建常態化質控體系，實現全過程可控

• 使用參考微球進行日常校準

• 采用正交方法進行結果比對

• 實施雙人復核和數據審計

• 遵循 USP 1044 要求，使用至少兩種獨立方法評估解凍后活率

本文通過梳理近五年PubMed數據庫中GMP合規細胞生產相關研究文獻，系統總結了主流細胞治療產品的計數技術應用體系，不同品類產品已形成適配自身特性的專屬檢測方案：

圖2 不同細胞治療產品的計數方法與染料使用情況

A：各類產品常用計數方法的文獻數量；B：各類產品常用活率染料的文獻數量

• MSC 產品：以自動圖像分析為主，常用染料為臺盼藍和 AO/PI

• T/NK 細胞產品：自動圖像分析和流式細胞術并重，臺盼藍使用最廣泛

• HPC 產品：血液分析儀是主要的計數工具

在產品放行標準層面，FDA對上市細胞治療產品建立了統一的活力底線要求，常規產品細胞活率不得低于70%，各類主流產品的具體放行規范如下：

• Kymriah?(CAR-T)：活率≥70%，劑量范圍 0.2-5.0×10?個 /kg (≤50kg)

• 臍帶血 HPC：總有核細胞活率≥85%

• Prochymal?(MSC)：活率≥70%

值得關注的是，臨床研究數據顯示，CAR-T產品細胞活率處于70%-80%區間時，患者臨床療效與高活率產品無顯著差異。但在商業化放行中，若產品活率低于法定標準，企業必須提供充足的安全性、有效性研究數據，證明產品質量與臨床應用不受影響，方可完成合規放行。

五、未來展望：技術革新引領行業升級

隨著生物醫藥技術的迭代升級，細胞計數技術正朝著自動化、智能化、實時化、高精度的方向快速迭代，打破傳統檢測局限，賦能行業標準化升級：

• AI 賦能：深度學習算法顯著提高了復雜樣本的識別準確率

• 微流控技術：實現了單細胞水平的高精度計數和分析

• 在線監測：閉環生產系統中的實時細胞計數技術正在成熟

• 體內成像：NIR-II 熒光成像技術為體內細胞活率追蹤提供了可能

綜上所述，細胞計數是細胞治療產業化、標準化、臨床化發展的基石環節，其檢測精度與標準化水平，直接決定了細胞治療產品的質量上限與臨床安全底線。正視細胞計數的各類技術難點，依托科學的方法選型、標準化的流程管控、完善的質控體系持續優化，能夠有效提升細胞檢測精準度，筑牢細胞治療產品的質量與安全防線，助力前沿細胞治療技術規?；涞?、惠及更多患者。

識別微信二維碼，添加生物制品圈小編，符合條件者即可加入

生物制品微信群！

請注明：姓名+研究方向！

本公眾號所有轉載文章系出于傳遞更多信息之目的，且明確注明來源和作者，不希望被轉載的媒體或個人可與我們聯系(cbplib@163.com)，我們將立即進行刪除處理。所有文章僅代表作者觀不本站。