豆科植物能夠與根瘤菌建立共生關(guān)系，并在根部形成具有固氮能力的根瘤，將大氣氮轉(zhuǎn)化為植物可利用的氮素營養(yǎng)。這一過程不僅支撐豆科作物生長，也顯著降低其對化學(xué)氮肥的依賴，是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)和可持續(xù)生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)。

根瘤共生始于植物對根瘤菌信號的識別，該過程隨后激活早期結(jié)瘤基因表達(dá)，進(jìn)而協(xié)調(diào)根瘤菌侵染和根瘤器官形成。在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和大豆（Glycine max）等豆科植物中，GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子NSP1和NSP2在激活早期結(jié)瘤基因表達(dá)中發(fā)揮核心調(diào)控作用。已有研究表明，NSP1能夠結(jié)合ENOD11等早期結(jié)瘤基因啟動子，并且這一過程依賴于NSP1與NSP2的相互作用。然而，二者如何直接組裝成復(fù)合物，并進(jìn)一步影響DNA結(jié)合和結(jié)瘤形成，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)仍不清楚。

近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)徐曙彤團(tuán)隊(duì)聯(lián)合河南大學(xué)王學(xué)路團(tuán)隊(duì)在The Plant Cell發(fā)表了題為Structural basis of NSP1-NSP2 heterodimerization and its regulatory mechanism in legume nodulation的研究論文，解析了NSP1-NSP2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了NSP1-NSP2異源二聚化促進(jìn)NSP1結(jié)合DNA、進(jìn)而調(diào)控豆科結(jié)瘤的分子機(jī)制。

研究團(tuán)隊(duì)首先在體外重組表達(dá)并純化來自蒺藜苜蓿和大豆的NSP1-NSP2復(fù)合物，證明NSP1和NSP2可以形成穩(wěn)定復(fù)合物，且相互作用主要由二者C端GRAS結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)。在此基礎(chǔ)上，團(tuán)隊(duì)解析了2.4 ?分辨率的NSP1-NSP2復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析顯示，NSP1和NSP2以1:1比例形成異源二聚體，主要通過LHRI基序形成頭對頭的相互作用界面。與已報道的其他GRAS蛋白二聚化模式相比，NSP1-NSP2界面較小，呈三角形，由保守的疏水作用和極性相互作用共同穩(wěn)定。突變分析表明，該界面中的關(guān)鍵保守位點(diǎn)對NSP1-NSP2互作至關(guān)重要，這一結(jié)構(gòu)特征在豆科植物中具有功能保守性。

圖1. NSP1-NSP2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)

NSP1-NSP2異源二聚化如何影響結(jié)瘤信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)？研究團(tuán)隊(duì)利用ENOD11啟動子片段進(jìn)行電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）發(fā)現(xiàn)，NSP1單獨(dú)存在時只能較弱地結(jié)合DNA；NSP2自身雖不能檢測到DNA結(jié)合能力，卻可以顯著增強(qiáng)NSP1對ENOD11啟動子的結(jié)合。當(dāng)NSP1界面突變、難以與NSP2形成復(fù)合物時，這種增強(qiáng)作用隨之減弱。進(jìn)一步的大豆遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，破壞NSP1-NSP2互作會使結(jié)瘤缺陷難以恢復(fù)，說明二者的直接相互作用是根瘤形成所必需的功能環(huán)節(jié)。

除異源二聚化界面外，該研究還在NSP1中發(fā)現(xiàn)了一個此前未被認(rèn)識到的HCCC型鋅指結(jié)構(gòu)。該鋅指位于NSP1的PFYRE基序附近，其關(guān)鍵配位殘基在多種豆科植物NSP1同源蛋白中嚴(yán)格保守；ICP-MS檢測也進(jìn)一步支持NSP1能夠結(jié)合鋅離子。與經(jīng)典HCCC型鋅指不同，這一結(jié)構(gòu)模塊在其他GRAS蛋白中并不保守，提示其可能是豆科NSP1特有的結(jié)構(gòu)特征。功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，該鋅指不影響NSP1-NSP2復(fù)合物的整體穩(wěn)定性，卻會影響復(fù)合物的DNA結(jié)合能力。EDTA處理后，NSP1-NSP2復(fù)合物仍保持穩(wěn)定，但其結(jié)合ENOD11啟動子的能力下降；在大豆中，鋅指關(guān)鍵位點(diǎn)突變不會明顯影響GmNSP1a的轉(zhuǎn)錄水平或蛋白積累，卻顯著降低根瘤形成。這些結(jié)果說明，NSP1中的HCCC型鋅指通過影響DNA結(jié)合活性參與結(jié)瘤調(diào)控。

圖2. NSP1中特有HCCC型鋅指影響DNA結(jié)合和結(jié)瘤形成

綜上，該研究解析了豆科結(jié)瘤核心轉(zhuǎn)錄因子NSP1-NSP2復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，闡明了LHRI基序介導(dǎo)的異源二聚化如何增強(qiáng)NSP1的DNA結(jié)合能力，并發(fā)現(xiàn)豆科NSP1中特有的HCCC型鋅指結(jié)構(gòu)。該研究為理解 NSP1-NSP2 如何協(xié)同調(diào)控根瘤共生提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也提示鋅離子可能通過影響關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的 DNA 結(jié)合活性參與共生固氮調(diào)控，為進(jìn)一步解析金屬元素信號與豆科植物-根瘤菌互作之間的關(guān)系提供了新的線索。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院徐曙彤教授和河南大學(xué)王學(xué)路教授為論文共同通訊作者。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士研究生萬里豪和薛重玉以及河南大學(xué)青年教師何春梅為論文共同第一作者，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)已畢業(yè)碩士研究生陳凰綺和毛霞坤以及河南大學(xué)中州實(shí)驗(yàn)室助理實(shí)驗(yàn)師彭亞齊為共同作者。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)練興明教授參與了該研究。本研究得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、河南省重大科技專項(xiàng)、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)、農(nóng)業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及河南省中原學(xué)者等項(xiàng)目資助。

徐曙彤教授課題組隸屬于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、農(nóng)業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和湖北洪山實(shí)驗(yàn)室。主要利用X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡等結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段，結(jié)合生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物信息學(xué)等方法，研究具有重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物的作用機(jī)制。研究方向：（1）豆科植物-根瘤菌共生固氮的分子基礎(chǔ)；（2）細(xì)胞膜表面受體感知胞外信號的分子機(jī)制。學(xué)術(shù)成果發(fā)表在Nature Plants，Nature Communications，Plant Cell，PNAS等國際主流學(xué)術(shù)期刊。獲得國家自然科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等資助。課題組氛圍和諧，誠邀有結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)或植物遺傳研究背景的博士來課題組開展博士后研究。聯(lián)系方式：

xushutong@mail.hzau.edu.cn

王學(xué)路教授團(tuán)隊(duì)以豆科植物和根瘤菌為主要研究系統(tǒng)，采用多學(xué)科的方法揭示豆科植物與根瘤菌互作的遺傳、進(jìn)化和分子機(jī)制。近期王學(xué)路團(tuán)隊(duì)在大豆根瘤能量感受及碳源分配調(diào)控共生固氮的機(jī)制（Science, 2022；Exploration, 2024; Trends in Plant Science, 2024），光信號調(diào)控根瘤形成的機(jī)制（Science, 2021），大豆與根瘤菌匹配性的共進(jìn)化遺傳和分子機(jī)制（Nature Plants, 2021），激素和環(huán)境脅迫調(diào)控共生根瘤發(fā)育的分子機(jī)制（Molecular Plant, 2021；Plant Communications, 2023）和根瘤菌誘導(dǎo)的根瘤細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的機(jī)制（New Phytologist, 2022）等方面取得了系列重要進(jìn)展。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1093/plcell/koag161